作者icome (木村阿宅)
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标题Re: [求救] 请问有人用过中研院lentivirus express …
时间Thu May 13 12:08:39 2010
这支lentiviral vector好像不好做
最近把midi抽出来的plasmid拿去跑胶 才发现plasmid跟本就有问题
其中四个跑出来只有200bp有band
另外一个放大的空vector是比原本的稍小 但是也多了200bp的鬼东西
但当初mini prepare出来的plasmid是正确的!!同样的菌拿去放大就出问题!!
查了一些资料 说LTR很容易让plasmid发生recombination!
我用的是DH5alpha
其他实验室的人说 他们都是用stbl3做的...
不知道有没有人有类似经验?
: : 我目前用中研院给的pLKO AS2.neo做virus
: : 外源基因有成功接入
: : 用LNCaP当作被感染的细胞
: : 经感染後用G418处理约三天 没有看到细胞有死亡的现象
: : 且细胞型态有所改变 和使用shRNA病毒感染的状况一样
: : (变得较细长 因为对照组也有同样状态故应是一般状况)
: : 但是跑Western却看不到所要表现的蛋白!!
: : 一开始认为是cloning出问题 可能是frame shift
: : 但是四组实验组(独立的construct)都同样状况 我当初用Pfu 效果应该不会这麽糟!
: : 总之我会拿去定序 如果真的是四组都frame shift那也真是太赛了.. = =
: : 我想请问的是 如果不是construct出错 可能是哪里有问题呢?
: : 目前是猜测titer太低...但如果是MOI太低 在G418 selection时应该很多细胞死掉才对?
: : 怎麽样都想不透啊.......有人用这套系统成功表现过吗? 感谢回答!
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◆ From: 140.112.121.97
1F：推 aceliang:DH5alpha真的是卯起来recomb.，上次挑十颗错两颗...Orz 05/13 12:21
2F：推 Fourfish:之前有看到类似的文章 有人说要用stbl3才行 05/13 12:46
3F：→ icome:好像跟size有关 size比较小的像是shRNA不容易发生 05/14 18:21
4F：推 longko:目前我中量抽出来DNA都没问题耶~我是用DH5a~目前Lentivirus 05/15 22:20
5F：推 longko:感染的细胞有成功knockdown protein 在第五天测试的 05/15 22:28
6F：→ icome:楼上 我shRNA也是抽了快两年都没问题 一换成cDNA就不行了 05/16 15:12