作者dodomilk (豆漿)
看板Biotech
標題[求救] ligation的產物降解了？
時間Mon May 3 12:03:18 2010
實驗步驟
將insert(600 bp)及vector(7500 bp)以SapI及XhoI做double-digestion
產物跑gel 有很明顯的band在正確的位置上 double-digetion應該是成功的
將切下來的兩塊gel(分別包含insert及vector 共約500 ul)混合並融化後
加入beta-agarase分解gel (0.5X TBE + 1% low-melting agarose)
直接加入T4 DNA ligase及buffer 16度下反應17小時
以上是按照vector建議的步驟做的
但ligation產物跑膠卻沒任何東西 insert vector 環狀DNA 都沒有
transformation也沒長出東西
猜想大概被降解了
問題會出現在哪個地方呢？
目前想到 有可能是ligation的環境不對 0.5X TBE 可能不適合反應
不然就是ligase壞掉了
請各位解答
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.44.41
1F：推 micocat:ligation反應體積? transformation體積? 05/03 13:16
2F：推 Fourfish:好酷的作法..第一次看到..應該是整個環境不對 太複雜了 05/03 13:23
3F：推 icome:第一次看到+1 這樣做能做出來也很神... 05/03 14:28
4F：→ icome:ligation你的insert和vector要夠乾淨 而且反應體積要小 05/03 14:29
5F：→ icome:通常我只拿一點去跑膠算比例 剩下的clean up後再做ligation 05/03 14:31
6F：→ dodomilk:反應體積就是切下來的gel的體積 約500ul 05/03 15:37
7F：→ turtle24:我ligation體積只有15ul 原po跑膠看不到是不是根本太稀了 05/03 15:38
8F：→ dodomilk:我試試clean up之後再ligation看看 05/03 15:38
9F：→ ararthur:應該是太稀了啦 算一下你放多少DNA吧 05/03 18:28
10F：推 conective:這是說直接把兩片膠溶在一起 之後直接作ligation? 05/03 22:57
11F：→ Ianthegood:反應體積500 那enzyme加多少啊? 05/04 01:01
12F：→ dodomilk:4ul 05/04 06:14
13F：→ chaunen:太稀+1 何不通column? agarose也會影響到ligation 05/08 02:30