作者dodomilk (豆浆)
看板Biotech
标题[求救] ligation的产物降解了？
时间Mon May 3 12:03:18 2010
实验步骤
将insert(600 bp)及vector(7500 bp)以SapI及XhoI做double-digestion
产物跑gel 有很明显的band在正确的位置上 double-digetion应该是成功的
将切下来的两块gel(分别包含insert及vector 共约500 ul)混合并融化後
加入beta-agarase分解gel (0.5X TBE + 1% low-melting agarose)
直接加入T4 DNA ligase及buffer 16度下反应17小时
以上是按照vector建议的步骤做的
但ligation产物跑胶却没任何东西 insert vector 环状DNA 都没有
transformation也没长出东西
猜想大概被降解了
问题会出现在哪个地方呢？
目前想到 有可能是ligation的环境不对 0.5X TBE 可能不适合反应
不然就是ligase坏掉了
请各位解答
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.44.41
1F：推 micocat:ligation反应体积? transformation体积? 05/03 13:16
2F：推 Fourfish:好酷的作法..第一次看到..应该是整个环境不对 太复杂了 05/03 13:23
3F：推 icome:第一次看到+1 这样做能做出来也很神... 05/03 14:28
4F：→ icome:ligation你的insert和vector要够乾净 而且反应体积要小 05/03 14:29
5F：→ icome:通常我只拿一点去跑胶算比例 剩下的clean up後再做ligation 05/03 14:31
6F：→ dodomilk:反应体积就是切下来的gel的体积 约500ul 05/03 15:37
7F：→ turtle24:我ligation体积只有15ul 原po跑胶看不到是不是根本太稀了 05/03 15:38
8F：→ dodomilk:我试试clean up之後再ligation看看 05/03 15:38
9F：→ ararthur:应该是太稀了啦 算一下你放多少DNA吧 05/03 18:28
10F：推 conective:这是说直接把两片胶溶在一起 之後直接作ligation? 05/03 22:57
11F：→ Ianthegood:反应体积500 那enzyme加多少啊? 05/04 01:01
12F：→ dodomilk:4ul 05/04 06:14
13F：→ chaunen:太稀+1 何不通column? agarose也会影响到ligation 05/08 02:30