作者Fourfish (～四條魚～)
看板Biotech
標題Re: [求救] 請問vector與insert序列中皆有ATG？
時間Sat May 1 15:01:28 2010
※ 引述《wangba (原來...)》之銘言：
: 標題: Re: [求救] 請問vector與insert序列中皆有ATG？
: 時間: Sat May 1 04:49:31 2010
:
: ※ 引述《yp (熊皮)》之銘言：
: : 請問各位先進
: : 目前有一vector cloning site之前有設計一組ATG,
: : 而手邊要使用的insert 其起始序列也含有ATG,
: : 接入之後 經過計算 此兩個ATG是不同的frame.
: : 1. 請問這時的蛋白質表現是會為何？ (僅有vector的 僅有insert的 還是皆有?)
: : Insert的部份能夠表現出預期的蛋白質嗎？
我的經驗跟想法是 "不會產生insert的蛋白"
因為跟translation有關係
Translation的發生有一定的規則
通常以最接近ribosome binding site (RBS)的ATG開始translation
以prokaryote而言 這個RBS的位置也通常在promoter上
距離第一個ATG 也就是vector上的ATG約10bp
如果你用的是pET系列的vector 注意一下map就會發現這個特徵
所以 不管你的insert有沒有ATG cell都會以vector的ATG做translation
當insert跟vector ATG是不同的frame時 是產不出protein的
因此建議你重新設計primer把insert弄成in frame的吧
（這也是做clone所應該注意的第一步）
而如果是W大的作法
有難度存在
因為就像我上面說的 RBS跟第一個ATG只距離約10bp
要在不砍掉RBS的情形下拿掉vector ATG 必須要剛好有RE site在RBS跟ATG中間
就算不認為RBS是重要的 vector ATG前面也一定是promoter region
也要顧慮到會不會砍到operator、activator和promoter等region
所以 這樣做完plasmid有沒有能力產protein也是個大問題....
結論就是...
砍掉重clone比較快...
PS.我是沒做過把vector ATG拿掉
如果真的要做是有辦法 但作法就比較複雜 而且是否能產protein真的是個問題
:
:
: 如果是我 我的作法是拿掉Vector上的ATG
:
: 畢竟利用Vector上的ATG會多出幾個amino acid
:
: 並不是原來的序列
恕刪
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.205
1F：推 bluecsky:其實還有另外一招..你可以做site-direct mutatgenesis 05/01 17:16
2F：→ bluecsky:把前方的ATG給mutate掉 不過有沒有比較快是很難說 05/01 17:16
3F：→ bluecsky:但是要是你原本的clone就很難做 做很久才出來 05/01 17:17
4F：→ bluecsky:而且又沒有適合的vector來改得話 這一招你可以考慮 05/01 17:17
5F：推 tsubasawolfy:拿原本CLONE的primer把ATG拿掉不是比較快Orz 05/01 18:25
6F：→ tsubasawolfy:從拿到新的primer->PCR->ligation->O/N 兩天完成 05/01 18:27
7F：推 bee921:反過來說...如果我的promoter自己有ATG在上面，那我接到 05/01 18:28
8F：→ bee921:luciferase(pGL3)vector也會有兩個products嗎? 05/01 18:29
9F：→ bee921:那會影響測的數值的準確度嗎? 05/01 18:30
10F：推 bluecsky:拿掉原本的ATG是很簡單但是會讓他N端多一小段序列出來 05/01 19:46
11F：→ bluecsky:理論上2個ATG是可能都會做出來 但是reading frame的問題 05/01 19:47
12F：→ bluecsky:可能不會出現兩個差不多長的產物 會得話就 認命重做吧 05/01 19:48