作者Fourfish (～四条鱼～)
看板Biotech
标题Re: [求救] 请问vector与insert序列中皆有ATG？
时间Sat May 1 15:01:28 2010
※ 引述《wangba (原来...)》之铭言：
: 标题: Re: [求救] 请问vector与insert序列中皆有ATG？
: 时间: Sat May 1 04:49:31 2010
:
: ※ 引述《yp (熊皮)》之铭言：
: : 请问各位先进
: : 目前有一vector cloning site之前有设计一组ATG,
: : 而手边要使用的insert 其起始序列也含有ATG,
: : 接入之後 经过计算 此两个ATG是不同的frame.
: : 1. 请问这时的蛋白质表现是会为何？ (仅有vector的 仅有insert的 还是皆有?)
: : Insert的部份能够表现出预期的蛋白质吗？
我的经验跟想法是 "不会产生insert的蛋白"
因为跟translation有关系
Translation的发生有一定的规则
通常以最接近ribosome binding site (RBS)的ATG开始translation
以prokaryote而言 这个RBS的位置也通常在promoter上
距离第一个ATG 也就是vector上的ATG约10bp
如果你用的是pET系列的vector 注意一下map就会发现这个特徵
所以 不管你的insert有没有ATG cell都会以vector的ATG做translation
当insert跟vector ATG是不同的frame时 是产不出protein的
因此建议你重新设计primer把insert弄成in frame的吧
（这也是做clone所应该注意的第一步）
而如果是W大的作法
有难度存在
因为就像我上面说的 RBS跟第一个ATG只距离约10bp
要在不砍掉RBS的情形下拿掉vector ATG 必须要刚好有RE site在RBS跟ATG中间
就算不认为RBS是重要的 vector ATG前面也一定是promoter region
也要顾虑到会不会砍到operator、activator和promoter等region
所以 这样做完plasmid有没有能力产protein也是个大问题....
结论就是...
砍掉重clone比较快...
PS.我是没做过把vector ATG拿掉
如果真的要做是有办法 但作法就比较复杂 而且是否能产protein真的是个问题
:
:
: 如果是我 我的作法是拿掉Vector上的ATG
:
: 毕竟利用Vector上的ATG会多出几个amino acid
:
: 并不是原来的序列
恕删
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.205
1F：推 bluecsky:其实还有另外一招..你可以做site-direct mutatgenesis 05/01 17:16
2F：→ bluecsky:把前方的ATG给mutate掉 不过有没有比较快是很难说 05/01 17:16
3F：→ bluecsky:但是要是你原本的clone就很难做 做很久才出来 05/01 17:17
4F：→ bluecsky:而且又没有适合的vector来改得话 这一招你可以考虑 05/01 17:17
5F：推 tsubasawolfy:拿原本CLONE的primer把ATG拿掉不是比较快Orz 05/01 18:25
6F：→ tsubasawolfy:从拿到新的primer->PCR->ligation->O/N 两天完成 05/01 18:27
7F：推 bee921:反过来说...如果我的promoter自己有ATG在上面，那我接到 05/01 18:28
8F：→ bee921:luciferase(pGL3)vector也会有两个products吗? 05/01 18:29
9F：→ bee921:那会影响测的数值的准确度吗? 05/01 18:30
10F：推 bluecsky:拿掉原本的ATG是很简单但是会让他N端多一小段序列出来 05/01 19:46
11F：→ bluecsky:理论上2个ATG是可能都会做出来 但是reading frame的问题 05/01 19:47
12F：→ bluecsky:可能不会出现两个差不多长的产物 会得话就 认命重做吧 05/01 19:48