※ 引述《yp (熊皮)》之銘言： : 請問各位先進 : 目前有一vector cloning site之前有設計一組ATG, : 而手邊要使用的insert 其起始序列也含有ATG, : 接入之後 經過計算 此兩個ATG是不同的frame. : 1. 請問這時的蛋白質表現是會為何？ (僅有vector的 僅有insert的 還是皆有?) : Insert的部份能夠表現出預期的蛋白質嗎？ : 2. 若是不行的話 請問各位有何建議？ : 如：需重設計引子 然後使用vector的ATG? : 換掉vector? (由於實驗限制 這點暫不考慮) : ......... 如果是我 我的作法是拿掉Vector上的ATG 畢竟利用Vector上的ATG會多出幾個amino acid 並不是原來的序列 至於說要如何拿掉呢 我用圖示來說明好了 EcoRI V BamHI I GAATTC ---ATG---GGATCC--ATG--- ===>digest with EcoRI and BamHI ===>run gel to remove Vector's ATG ===>klenow fill in and ligase ===> GAATTGATCC--ATG 當然 這裡的 EcoRI 和 BamHI只是舉例 如果沒有適合的cutting site 同樣的方法也可以改在inser上 使其in frame 比如說 V BamHI I ATG CA GGATCC ATG ===>digest with BamHI ===>klenow fill in and linase ===>ATG CA G GAT C GA TCC ATG 同樣地 這裡的BamHI也只是舉例 要注意的是klenow只能補齊5'突出的cutting site 像是3'突出的KpnI就不能用這方法 只能用nuclease digest的方法 同時如圖示 一次多幾個base是由突出幾個base決定的 除了klenow之外 也可以用polymerase補齊 至於如何使用klenow就要參照使用說明 不在這篇的討論範圍 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.129.9