※ 引述《yp (熊皮)》之铭言： : 请问各位先进 : 目前有一vector cloning site之前有设计一组ATG, : 而手边要使用的insert 其起始序列也含有ATG, : 接入之後 经过计算 此两个ATG是不同的frame. : 1. 请问这时的蛋白质表现是会为何？ (仅有vector的 仅有insert的 还是皆有?) : Insert的部份能够表现出预期的蛋白质吗？ : 2. 若是不行的话 请问各位有何建议？ : 如：需重设计引子 然後使用vector的ATG? : 换掉vector? (由於实验限制 这点暂不考虑) : ......... 如果是我 我的作法是拿掉Vector上的ATG 毕竟利用Vector上的ATG会多出几个amino acid 并不是原来的序列 至於说要如何拿掉呢 我用图示来说明好了 EcoRI V BamHI I GAATTC ---ATG---GGATCC--ATG--- ===>digest with EcoRI and BamHI ===>run gel to remove Vector's ATG ===>klenow fill in and ligase ===> GAATTGATCC--ATG 当然 这里的 EcoRI 和 BamHI只是举例 如果没有适合的cutting site 同样的方法也可以改在inser上 使其in frame 比如说 V BamHI I ATG CA GGATCC ATG ===>digest with BamHI ===>klenow fill in and linase ===>ATG CA G GAT C GA TCC ATG 同样地 这里的BamHI也只是举例 要注意的是klenow只能补齐5'突出的cutting site 像是3'突出的KpnI就不能用这方法 只能用nuclease digest的方法 同时如图示 一次多几个base是由突出几个base决定的 除了klenow之外 也可以用polymerase补齐 至於如何使用klenow就要参照使用说明 不在这篇的讨论范围 --

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