作者icome (木村阿宅)
看板Biotech
標題Re: [求救] 請問有人用過中研院lentivirus express …
時間Wed Apr 28 12:46:46 2010
日前中研院打電話來說 當初給我的vector可能是抗puro不是抗neo...
我從先前定序的資料去比對 確定是as2.puro這支
以為找到原因 很高興地用pruo去篩 (用T47D細胞)
四天後control組大概死了一半 被感染的細胞活得很正常
想說終於成功了吧! 很興奮地去跑western...
結果!!還是沒東西!!連一點鬼影都沒有!!
拿去定sequence 從頭到尾完全正確!!
vector上的PCMV序列我也有對過 完全無誤!!
有人可以解釋這個詭異的現象嗎.........
※ 引述《icome (木村阿宅)》之銘言：
: 我目前用中研院給的pLKO AS2.neo做virus
: 外源基因有成功接入
: 用LNCaP當作被感染的細胞
: 經感染後用G418處理約三天 沒有看到細胞有死亡的現象
: 且細胞型態有所改變 和使用shRNA病毒感染的狀況一樣
: (變得較細長 因為對照組也有同樣狀態故應是一般狀況)
: 但是跑Western卻看不到所要表現的蛋白!!
: 一開始認為是cloning出問題 可能是frame shift
: 但是四組實驗組(獨立的construct)都同樣狀況 我當初用Pfu 效果應該不會這麼糟!
: 總之我會拿去定序 如果真的是四組都frame shift那也真是太賽了.. = =
: 我想請問的是 如果不是construct出錯 可能是哪裡有問題呢?
: 目前是猜測titer太低...但如果是MOI太低 在G418 selection時應該很多細胞死掉才對?
: 怎麼樣都想不透啊.......有人用這套系統成功表現過嗎? 感謝回答!
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◆ From: 140.112.121.97
1F：推 ranilla:我建議你在普通的vector上確定可表現後，從CMV promoter到 04/28 13:20
2F：→ ranilla:op codon一起移過去virus vector，我之前有過在atg前多1個 04/28 13:22
3F：→ ranilla:mer，我的蛋白就可從無到有，你必須用軟體檢查一下ORF 04/28 13:23
4F：→ ranilla:比如說pDRAW或vector NTI 04/28 13:24
5F：→ icome:我的start codon前後有符合Kozak序列 我直接送看看好了 唉 04/28 17:43