作者icome (木村阿宅)
看板Biotech
标题Re: [求救] 请问有人用过中研院lentivirus express …
时间Wed Apr 28 12:46:46 2010
日前中研院打电话来说 当初给我的vector可能是抗puro不是抗neo...
我从先前定序的资料去比对 确定是as2.puro这支
以为找到原因 很高兴地用pruo去筛 (用T47D细胞)
四天後control组大概死了一半 被感染的细胞活得很正常
想说终於成功了吧! 很兴奋地去跑western...
结果!!还是没东西!!连一点鬼影都没有!!
拿去定sequence 从头到尾完全正确!!
vector上的PCMV序列我也有对过 完全无误!!
有人可以解释这个诡异的现象吗.........
※ 引述《icome (木村阿宅)》之铭言：
: 我目前用中研院给的pLKO AS2.neo做virus
: 外源基因有成功接入
: 用LNCaP当作被感染的细胞
: 经感染後用G418处理约三天 没有看到细胞有死亡的现象
: 且细胞型态有所改变 和使用shRNA病毒感染的状况一样
: (变得较细长 因为对照组也有同样状态故应是一般状况)
: 但是跑Western却看不到所要表现的蛋白!!
: 一开始认为是cloning出问题 可能是frame shift
: 但是四组实验组(独立的construct)都同样状况 我当初用Pfu 效果应该不会这麽糟!
: 总之我会拿去定序 如果真的是四组都frame shift那也真是太赛了.. = =
: 我想请问的是 如果不是construct出错 可能是哪里有问题呢?
: 目前是猜测titer太低...但如果是MOI太低 在G418 selection时应该很多细胞死掉才对?
: 怎麽样都想不透啊.......有人用这套系统成功表现过吗? 感谢回答!
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◆ From: 140.112.121.97
1F：推 ranilla:我建议你在普通的vector上确定可表现後，从CMV promoter到 04/28 13:20
2F：→ ranilla:op codon一起移过去virus vector，我之前有过在atg前多1个 04/28 13:22
3F：→ ranilla:mer，我的蛋白就可从无到有，你必须用软体检查一下ORF 04/28 13:23
4F：→ ranilla:比如说pDRAW或vector NTI 04/28 13:24
5F：→ icome:我的start codon前後有符合Kozak序列 我直接送看看好了 唉 04/28 17:43