作者sheepfeather (187)
看板Biotech
標題Re: [求救] 如何使重組蛋白變成soluble protein
時間Sun Apr 25 00:41:07 2010
※ 引述《what15 (小蛙)》之銘言：
: 小妹目前在做重組蛋白的表現
: 使用的E.col為BL-21
: vector為pET-20b
: 實驗到目前做的還蠻順利的
: 不過表現出來的蛋白會形成inclusion body
: 也有用denature buffer 純化出來
: 由於protein denature 後會影響protein activity
: 所以老闆希望我能想辦法讓recombinant protein直接變成 soluble
: 也就是維持它原有的蛋白質活性 ＝ ＝
順便問一下你是表現真核還原核的蛋白
因為真核的話，用 E.coli 有時會因為缺少醣化之類的修飾讓它活性.結構等變差
如果是原核的，就比較不用擔心這個問題囉
也要確定一下你的蛋白對E.coli來說是不是算有毒的
: 因此叫我try induction condiction
: 實驗室目前沒有人做過這一部份（通常都是直接玩denature/renature)
: 所以對於這個挑戰還蠻頭大的
: 小妹自己有查過資料
: 有些paper是說可加入chaperon 、heat shock protein或是換plasmid等等
: 但看起來都挺複雜的＠＠
: 不曉得有沒有人做過類似的實驗或是有看過相關的paper（篇幅太大可寄站內信）
: 希望大家能幫小妹指點迷津
: 感謝
常見會try的一些方法有
1.一般 inclusion body 的產生是因為蛋白的生產速度 > folding速度，所以可以透過
降溫、降轉速 induction (16度 20度 25度)、降 IPTG 濃度 (一般到 0.1 mM 都還
可以作用) 去爭取 folding 的時間。
2.也或許菌內的環境的環境不適合蛋白folding，所以可以嘗試換菌株去表現，BL-21(DE3)
是一般常用的，還可以試試 BL-21(DE3)Gold、BL-21(DE3)pLys、BL-21(DE3)Codon plus
、BL-21(DE3)Rosetta 等，甚至也聽過有人用 XLI-Blue 表現。
3.換vector，比如用有 lacI 的 pET-28a，或換成帶有 GST、MBP 等 tag 的 vector。
4.Induction 時加入 3~5% 的酒精誘導 E.coli 產生 chaperon 幫助 folding，不過
這我自己做起來沒很穩定就是了。也看過有 paper 加其他藥品比如 diglycine 等。
5.如果蛋白是因為 E.coli 自己的 chaperon 不會幫忙 folding 才變成inclusion body
，那 coexpress 可以作用的 chaperon 或許有幫助，不過技術跟花費相對也較難。
6.用生資軟體分析後把序列做 mutate 或 truncate。
7.真核的蛋白用真核系統去表現...(攤)。
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1F：推 KYOROD: Λ＿Λ 03/25 20:32
2F：推 newmatt: 咻 一 <丶‵∀′> 路過，大家繼續 03/25 20:34
3F：推 idolater: ＝〔~∪￣￣〕 03/25 20:46
4F：推 wrather: ＝ ◎──◎ 03/25 20:54
5F：推 jeffqoo2002:路路路路路路路路路路路路路 路路路路路路路路X03/25 20:57
6F：推 devilshadow:路路路路路路路路路路路路路△△△△路路路路路路路03/25 21:47
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.97.110
※ 編輯: sheepfeather 來自: 140.114.97.110 (04/25 01:01)
7F：推 jykonv23:3~5%酒精 還真沒試過 04/25 02:05
8F：推 conective:推薦這篇文章 04/25 14:36
9F：推 what15:我表現的是病毒的蛋白@@ 謝謝專業的解析 04/25 17:38
10F：→ what15:小妹會先嘗試看看 如有問題再向大大請教^^ 04/25 17:40
11F：推 slash7788:推本篇 只能說純化是ㄧ條不歸路阿 04/26 16:51
12F：→ slash7788:不考慮直接refolding??? 04/26 16:51
13F：推 bluecsky:refolding回去也不見得是原本的folding... 04/26 18:34
14F：→ bluecsky:能直接拿native protein是最好的選擇 refolding問題多 04/26 18:34
15F：→ bluecsky:只是拿native protein是很看運氣就是了 04/26 18:35
16F：推 what15:唉～老闆這麼說只好這麼做嚕>< 04/27 00:08
17F：→ slash7788:其實native form也不見的就是 真正的folding 04/27 09:28
18F：→ slash7788:只是大家比較認可 不過能不產生inclusion body最好 04/27 09:29
19F：→ slash7788:目前試過chaperon大概是最好 通常都可以產出少量的 04/27 09:30
20F：→ slash7788:native form 不過要純化出來 要很大量 04/27 09:31
21F：→ bluecsky:沒辦法阿 大家比較認可native form = 真正的folding 04/27 19:00
22F：→ bluecsky:所以搞蛋白純化才會這麼累 不然要拿denature的簡單很多 04/27 19:01
23F：→ bluecsky:基本上只要能induction出來 就可以有暴力解 不管溶不溶 04/27 19:02
24F：推 skyken10:在OD0.2的時候就induction~induction時間短一點~ 04/27 22:40
25F：→ skyken10:降低蛋白質的產量可以讓inclusion body降低很多 04/27 22:45
再補充一些
確定可以有soluble protein 後，induction 完先把你的菌放到4度C冰個3~4個小時
再看後續你要離心起來冰存還直接破菌純化
我的case是有冰過4度c的菌比起沒有冰過的，純化後的蛋白產量多了2~3倍
另外換不同medium養看看，比如LB換2YT，有時候也會有意外的結果 給你參考
※ 編輯: sheepfeather 來自: 140.114.97.110 (04/28 03:39)
26F：推 abc0574:s大的講解真詳細 偷學一點回去 05/10 16:54