作者sheepfeather (187)
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标题Re: [求救] 如何使重组蛋白变成soluble protein
时间Sun Apr 25 00:41:07 2010
※ 引述《what15 (小蛙)》之铭言：
: 小妹目前在做重组蛋白的表现
: 使用的E.col为BL-21
: vector为pET-20b
: 实验到目前做的还蛮顺利的
: 不过表现出来的蛋白会形成inclusion body
: 也有用denature buffer 纯化出来
: 由於protein denature 後会影响protein activity
: 所以老板希望我能想办法让recombinant protein直接变成 soluble
: 也就是维持它原有的蛋白质活性 ＝ ＝
顺便问一下你是表现真核还原核的蛋白
因为真核的话，用 E.coli 有时会因为缺少醣化之类的修饰让它活性.结构等变差
如果是原核的，就比较不用担心这个问题罗
也要确定一下你的蛋白对E.coli来说是不是算有毒的
: 因此叫我try induction condiction
: 实验室目前没有人做过这一部份（通常都是直接玩denature/renature)
: 所以对於这个挑战还蛮头大的
: 小妹自己有查过资料
: 有些paper是说可加入chaperon 、heat shock protein或是换plasmid等等
: 但看起来都挺复杂的＠＠
: 不晓得有没有人做过类似的实验或是有看过相关的paper（篇幅太大可寄站内信）
: 希望大家能帮小妹指点迷津
: 感谢
常见会try的一些方法有
1.一般 inclusion body 的产生是因为蛋白的生产速度 > folding速度，所以可以透过
降温、降转速 induction (16度 20度 25度)、降 IPTG 浓度 (一般到 0.1 mM 都还
可以作用) 去争取 folding 的时间。
2.也或许菌内的环境的环境不适合蛋白folding，所以可以尝试换菌株去表现，BL-21(DE3)
是一般常用的，还可以试试 BL-21(DE3)Gold、BL-21(DE3)pLys、BL-21(DE3)Codon plus
、BL-21(DE3)Rosetta 等，甚至也听过有人用 XLI-Blue 表现。
3.换vector，比如用有 lacI 的 pET-28a，或换成带有 GST、MBP 等 tag 的 vector。
4.Induction 时加入 3~5% 的酒精诱导 E.coli 产生 chaperon 帮助 folding，不过
这我自己做起来没很稳定就是了。也看过有 paper 加其他药品比如 diglycine 等。
5.如果蛋白是因为 E.coli 自己的 chaperon 不会帮忙 folding 才变成inclusion body
，那 coexpress 可以作用的 chaperon 或许有帮助，不过技术跟花费相对也较难。
6.用生资软体分析後把序列做 mutate 或 truncate。
7.真核的蛋白用真核系统去表现...(摊)。
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1F：推 KYOROD: Λ＿Λ 03/25 20:32
2F：推 newmatt: 咻 一 <丶‵∀′> 路过，大家继续 03/25 20:34
3F：推 idolater: ＝〔~∪￣￣〕 03/25 20:46
4F：推 wrather: ＝ ◎──◎ 03/25 20:54
5F：推 jeffqoo2002:路路路路路路路路路路路路路 路路路路路路路路X03/25 20:57
6F：推 devilshadow:路路路路路路路路路路路路路△△△△路路路路路路路03/25 21:47
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.97.110
※ 编辑: sheepfeather 来自: 140.114.97.110 (04/25 01:01)
7F：推 jykonv23:3~5%酒精 还真没试过 04/25 02:05
8F：推 conective:推荐这篇文章 04/25 14:36
9F：推 what15:我表现的是病毒的蛋白@@ 谢谢专业的解析 04/25 17:38
10F：→ what15:小妹会先尝试看看 如有问题再向大大请教^^ 04/25 17:40
11F：推 slash7788:推本篇 只能说纯化是ㄧ条不归路阿 04/26 16:51
12F：→ slash7788:不考虑直接refolding??? 04/26 16:51
13F：推 bluecsky:refolding回去也不见得是原本的folding... 04/26 18:34
14F：→ bluecsky:能直接拿native protein是最好的选择 refolding问题多 04/26 18:34
15F：→ bluecsky:只是拿native protein是很看运气就是了 04/26 18:35
16F：推 what15:唉～老板这麽说只好这麽做噜>< 04/27 00:08
17F：→ slash7788:其实native form也不见的就是 真正的folding 04/27 09:28
18F：→ slash7788:只是大家比较认可 不过能不产生inclusion body最好 04/27 09:29
19F：→ slash7788:目前试过chaperon大概是最好 通常都可以产出少量的 04/27 09:30
20F：→ slash7788:native form 不过要纯化出来 要很大量 04/27 09:31
21F：→ bluecsky:没办法阿 大家比较认可native form = 真正的folding 04/27 19:00
22F：→ bluecsky:所以搞蛋白纯化才会这麽累 不然要拿denature的简单很多 04/27 19:01
23F：→ bluecsky:基本上只要能induction出来 就可以有暴力解 不管溶不溶 04/27 19:02
24F：推 skyken10:在OD0.2的时候就induction~induction时间短一点~ 04/27 22:40
25F：→ skyken10:降低蛋白质的产量可以让inclusion body降低很多 04/27 22:45
再补充一些
确定可以有soluble protein 後，induction 完先把你的菌放到4度C冰个3~4个小时
再看後续你要离心起来冰存还直接破菌纯化
我的case是有冰过4度c的菌比起没有冰过的，纯化後的蛋白产量多了2~3倍
另外换不同medium养看看，比如LB换2YT，有时候也会有意外的结果 给你参考
※ 编辑: sheepfeather 来自: 140.114.97.110 (04/28 03:39)
26F：推 abc0574:s大的讲解真详细 偷学一点回去 05/10 16:54