※ 引述《complexomic (複合質體)》之銘言： : 我目前想要收細胞下來，然後破細胞，收集胞內蛋白 : 之前跑2D是先將dish裡面的medium吸掉，再用PBS wash : 然後加入ripa 500uL 下去破細胞，然後酒精沉澱 : 再用Rehydration buffer回溶，接著就上IEF，再上電泳 : 目前我要做western，實驗室其他有做western的人說 : 先不要把dish裡面的medium吸掉，而是先用PBS wssh : 然後ripa量不要下這麼大，否則會影響接下來的western : 我想請問，真的會影響嗎??? 我之前下這樣的量 : 2D跑起來也還OK，只是不知道western這樣做真的會影響嗎 你不先把medium 吸掉 要如何PBS洗?? 我一直以為 PBS 是用來洗掉多餘的medium以及你不想要的死細胞 因為medium內有大量的serum 蛋白 你不想看 RIPA的量不要加太大沒錯 因為你這樣可以有比較高的蛋白質濃度 我通常是加100~200ul 之間 取決於cell pellet大小 給你當參考 另外我補上我們實驗室的一些步驟 1. 抽medium, 用 PBS wash the cell, 移除死細胞 2. trypisinize 細胞. 離心 3. 抽上清液, 用冷的Ca/Mg free PBS, 加到細胞pellet的試管裡 4. 在離心 5. 抽去PBS, 加RIPA以及protease inhibitor 之所以用Ca/Mg free PBS是為了避免Ca dependent protease 所可能造成的degredation. 你可以參考看看 -- 我的blog 歡迎參觀 http://www.wretch.cc/blog/reinherd --

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