※ 引述《complexomic (复合质体)》之铭言： : 我目前想要收细胞下来，然後破细胞，收集胞内蛋白 : 之前跑2D是先将dish里面的medium吸掉，再用PBS wash : 然後加入ripa 500uL 下去破细胞，然後酒精沉淀 : 再用Rehydration buffer回溶，接着就上IEF，再上电泳 : 目前我要做western，实验室其他有做western的人说 : 先不要把dish里面的medium吸掉，而是先用PBS wssh : 然後ripa量不要下这麽大，否则会影响接下来的western : 我想请问，真的会影响吗??? 我之前下这样的量 : 2D跑起来也还OK，只是不知道western这样做真的会影响吗 你不先把medium 吸掉 要如何PBS洗?? 我一直以为 PBS 是用来洗掉多余的medium以及你不想要的死细胞 因为medium内有大量的serum 蛋白 你不想看 RIPA的量不要加太大没错 因为你这样可以有比较高的蛋白质浓度 我通常是加100~200ul 之间 取决於cell pellet大小 给你当参考 另外我补上我们实验室的一些步骤 1. 抽medium, 用 PBS wash the cell, 移除死细胞 2. trypisinize 细胞. 离心 3. 抽上清液, 用冷的Ca/Mg free PBS, 加到细胞pellet的试管里 4. 在离心 5. 抽去PBS, 加RIPA以及protease inhibitor 之所以用Ca/Mg free PBS是为了避免Ca dependent protease 所可能造成的degredation. 你可以参考看看 -- 我的blog 欢迎参观 http://www.wretch.cc/blog/reinherd --

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