不知道在版上可不可以分享kit的實驗流程 若不行請告知一聲，我會刪除的 會想要分享這篇主要是因為看步驟兩個小時左右 就可以搞定的東西，卻花掉我半天的時間，真的很 抓狂，尤其是其中一個步驟很搞剛，用掉超多時間的... 以上閒話講完了，進入這套kit的說明吧~ 這套kit是用於分離細胞或是組織的細胞質,核及膜的 技術，比起傳統的方式，一般平均需要兩天的工程吧， 相對於這套kit方便多了，時間也省下不少呢。 這邊我是使用皮膚角質層細胞HacaT 細胞，也許是因為 這種細胞的特性特別堅強，害我要打破細胞花掉1.5小時 真的很無奈... 這組kit有限制細胞，最高可以使用2*10的7次方細胞數， 最低可以使用2.5*106細胞，因為在步驟裡已經標示好 最高細胞數所需要的buffer量，所以我第一次先使用 4*106細胞數，方便換算說明書裡面需要用的量。 我是種在6 well裡面medium去除，PBS洗兩次，加 trypsin-EDTA，切下細胞，收集到小tube裡，室溫,2000rpm,5min 去除trypsin-EDTA，加入kit的buffer C 400ul (額外加入ki附的 protein inhibitors cocktail 3.18ul)，4C，搖20分鐘 2. 接著使用針頭孔徑26.5~30的針打破細胞，在這邊我是用 孔徑30，1CC包裝的針打破細胞，讓細胞質出來，在這邊說明書上 提到說大約來回沖打細胞50~90次左右，就可以使細胞破裂至95% 原本還在想說要這麼多次，手部就酸死了，一開始還很有耐心的數 沖打幾次，半小時過去了，我也懶的數了，取幾滴放到6 well的蓋子上 拿到顯微鏡下面觀察，這些細胞也太健壯了吧，每顆細胞都完好如初 是我對你們太溫柔了吧...接下來我就決定將細胞抽起來在大力的 衝到tube裡，兩三次後，tube裡面的泡泡變多，再放慢速度沖打 這樣來回半小時後，心想這樣沒問題了吧，在取一些到顯微鏡下面觀察 確實跟上一次看到的細胞數比較有比較少了，但還是有很多細胞 很強壯，就是不破，是因為皮膚細胞特別堅強嗎?只好再繼續沖打的 動作...持續了1.5小時，再次觀察，終於阿，我可以離開沖打細胞的 窘境裡了，在顯微鏡下看，細胞數量已經寥寥無幾了，照理說 應該要在多打幾下的，但是我已經在這個步驟花掉太多時間了，決定 往下個步驟走，4C,13000rpm,20min，保留上清液(這就是我要的細胞質阿) 3. 清洗一下pellet，取kit的 buffer W 800ul(加protein inhibitor 6.36ul) 在4C,搖5min，接著4C,13000rpm,20min，丟掉上清液 4. 加入 buffer N 200ul (加protein inhibitor 1.59ul)，在4C,搖5min 接著4C,13000rpm,20min保留上清液(收集到第二個細胞核啦~) 5. 直接加入buffer M 200ul (加protein inhibitor 1.59ul)在 4C搖5min，接著4C,13000rpm,20min保留上清液(連細胞膜的部分也到手了) 6. 接著就是測濃度~原本想說每一管的量至少都有200ul可以用很多次 沒問題吧，測出來卻發現細胞質濃度高>細胞核>細胞膜... 假設細胞質的濃度是1ug/ul，細胞核就是0.5ug/ul 細胞膜更慘，只有0.3ug/ul左右，也太低了吧，這樣我跑western 是要load多少阿...跟老闆說明這情形之後，老闆說其實測細胞質核膜 濃度不用到非常高，不然就是細胞質和核都用15ug，細胞膜用10ug 跑一次western，壓不同抗體看看有沒有分離乾淨，下次再做實驗 的時候可以把buffer的量都減少，這樣濃度就會提高了。 我也是這樣想的，所以以上的步驟流程是我第一次做的量，第二次 再抽細胞質核膜我就會把抽細胞核和膜的體積都減少， 細胞質(buffer C)加 400ul 細胞核(buffer N)加 100ul 細胞膜(buffer M)加 50ul 這樣濃度應該就可以提升了吧~哈哈，等我在做一次再看看吧， 但是我不是很想再碰這個實驗了耶...再抽打細胞那個步驟花掉我 超多時間的，連中餐都是請同事幫我買回來的，真的很麻煩... 以上的閒聊加分享到此告一段落啦，若是不能po這種文章請告知 我會盡快刪除，謝謝大家耐心的看完我的文章阿... 寫文章都沒有做實驗累了，雖然說比這個實驗更複雜的實驗一大堆 但是就是想上來抒發一下~~ --

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