不知道在版上可不可以分享kit的实验流程 若不行请告知一声，我会删除的 会想要分享这篇主要是因为看步骤两个小时左右 就可以搞定的东西，却花掉我半天的时间，真的很 抓狂，尤其是其中一个步骤很搞刚，用掉超多时间的... 以上闲话讲完了，进入这套kit的说明吧~ 这套kit是用於分离细胞或是组织的细胞质,核及膜的 技术，比起传统的方式，一般平均需要两天的工程吧， 相对於这套kit方便多了，时间也省下不少呢。 这边我是使用皮肤角质层细胞HacaT 细胞，也许是因为 这种细胞的特性特别坚强，害我要打破细胞花掉1.5小时 真的很无奈... 这组kit有限制细胞，最高可以使用2*10的7次方细胞数， 最低可以使用2.5*106细胞，因为在步骤里已经标示好 最高细胞数所需要的buffer量，所以我第一次先使用 4*106细胞数，方便换算说明书里面需要用的量。 我是种在6 well里面medium去除，PBS洗两次，加 trypsin-EDTA，切下细胞，收集到小tube里，室温,2000rpm,5min 去除trypsin-EDTA，加入kit的buffer C 400ul (额外加入ki附的 protein inhibitors cocktail 3.18ul)，4C，摇20分钟 2. 接着使用针头孔径26.5~30的针打破细胞，在这边我是用 孔径30，1CC包装的针打破细胞，让细胞质出来，在这边说明书上 提到说大约来回冲打细胞50~90次左右，就可以使细胞破裂至95% 原本还在想说要这麽多次，手部就酸死了，一开始还很有耐心的数 冲打几次，半小时过去了，我也懒的数了，取几滴放到6 well的盖子上 拿到显微镜下面观察，这些细胞也太健壮了吧，每颗细胞都完好如初 是我对你们太温柔了吧...接下来我就决定将细胞抽起来在大力的 冲到tube里，两三次後，tube里面的泡泡变多，再放慢速度冲打 这样来回半小时後，心想这样没问题了吧，在取一些到显微镜下面观察 确实跟上一次看到的细胞数比较有比较少了，但还是有很多细胞 很强壮，就是不破，是因为皮肤细胞特别坚强吗?只好再继续冲打的 动作...持续了1.5小时，再次观察，终於阿，我可以离开冲打细胞的 窘境里了，在显微镜下看，细胞数量已经寥寥无几了，照理说 应该要在多打几下的，但是我已经在这个步骤花掉太多时间了，决定 往下个步骤走，4C,13000rpm,20min，保留上清液(这就是我要的细胞质阿) 3. 清洗一下pellet，取kit的 buffer W 800ul(加protein inhibitor 6.36ul) 在4C,摇5min，接着4C,13000rpm,20min，丢掉上清液 4. 加入 buffer N 200ul (加protein inhibitor 1.59ul)，在4C,摇5min 接着4C,13000rpm,20min保留上清液(收集到第二个细胞核啦~) 5. 直接加入buffer M 200ul (加protein inhibitor 1.59ul)在 4C摇5min，接着4C,13000rpm,20min保留上清液(连细胞膜的部分也到手了) 6. 接着就是测浓度~原本想说每一管的量至少都有200ul可以用很多次 没问题吧，测出来却发现细胞质浓度高>细胞核>细胞膜... 假设细胞质的浓度是1ug/ul，细胞核就是0.5ug/ul 细胞膜更惨，只有0.3ug/ul左右，也太低了吧，这样我跑western 是要load多少阿...跟老板说明这情形之後，老板说其实测细胞质核膜 浓度不用到非常高，不然就是细胞质和核都用15ug，细胞膜用10ug 跑一次western，压不同抗体看看有没有分离乾净，下次再做实验 的时候可以把buffer的量都减少，这样浓度就会提高了。 我也是这样想的，所以以上的步骤流程是我第一次做的量，第二次 再抽细胞质核膜我就会把抽细胞核和膜的体积都减少， 细胞质(buffer C)加 400ul 细胞核(buffer N)加 100ul 细胞膜(buffer M)加 50ul 这样浓度应该就可以提升了吧~哈哈，等我在做一次再看看吧， 但是我不是很想再碰这个实验了耶...再抽打细胞那个步骤花掉我 超多时间的，连中餐都是请同事帮我买回来的，真的很麻烦... 以上的闲聊加分享到此告一段落啦，若是不能po这种文章请告知 我会尽快删除，谢谢大家耐心的看完我的文章阿... 写文章都没有做实验累了，虽然说比这个实验更复杂的实验一大堆 但是就是想上来抒发一下~~ --

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