關於polyacrylamide electrophoresis的部分 Denaturing electrophoresis: (請把字看清楚喔!!) Reducing condition - Sample dye 含2-Me或DTT Buffer 含SDS Sample 要煮 Non-reducing condition - Sample dye "不含"2-Me或DTT Buffer 含SDS Sample "不能"煮 以上兩者都可稱為SDS-PAGE 因為都含SDS 差別只在於reducing reagent的有無 SDS可讓proteins帶負電 但也會破壞non-covalent bond 影響complex及可能影響protein folding 所以non-reducing的proteins也並非在native的狀態 (所以稱denature) 但部分可以保留住protein的structural epitope供Ab辨識 Non-denaturing electrophoresis: Native condition 也就是所謂的native PAGE 所有dye、buffer都不含2-Me或DTT及SDS [所以sample dye只含有buffer(控制pH)、glycerol(沈降)跟tracing dye] Sample不能煮 Buffer system也不太一樣(製膠跟running buffer) 我用過TBE 也看過Tris/Glycine的protocol 不過差異在哪我還不太清楚... 在Native PAGE中 讓proteins電泳只靠proteins自己的電性 可以透過protein PI跟調整buffer pH使之帶負電以進行電泳 但也因為變因太多(PI、pH、size、shape、complex、interaction等) 所以跟marker比對大多會不準...而且bands可能會很醜...XD PS.如果是棘手的membrane protein想在native下跑電泳 可參考"Blue native PAGE (BN-PAGE)" 以上是我對PAGE的瞭解 至於Western blotting的部分 只要proteins帶負電、可以跑電泳 那一定可以用電轉法將proteins transfer到membrane上 (因為原理跟電泳一樣啊~XD) SDS-PAGE無論是reducing或non-reducing一定沒問題 而native-PAGE則要控制電壓、時間、調整buffer等 你如果想做native-PAGE的Western blotting 請google一下 http://tinyurl.com/y39thp3 看完後你會發現... 基本上Western blotting的作法是一樣的...XD PS.我不解的是...你文中的意思應該做了兩次都有出來 但你老闆為什麼只在意有沒有SDS...= =a ※ 引述《sjacky (陳小文)》之銘言： : 大家好： : 最近買了一隻抗體 Chemicon, Anti-Apolipoprotein H : 在Datasheet http://0rz.tw/n6ZTL 上面有寫到non-reducing這個部份 : 問sells的結果他說,在sample buffer的部份不要加入B-me,其他部份都一樣 : 依照他的說法,做了兩次,結果拿給老闆看 : 老闆說 non-reducing的話,連SDS都不能加 : 想要請教一下,有沒有人有作過的 : 想要請教一下作法跟一般western blotting有什麼差別 : 謝謝 --

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