关於polyacrylamide electrophoresis的部分 Denaturing electrophoresis: (请把字看清楚喔!!) Reducing condition - Sample dye 含2-Me或DTT Buffer 含SDS Sample 要煮 Non-reducing condition - Sample dye "不含"2-Me或DTT Buffer 含SDS Sample "不能"煮 以上两者都可称为SDS-PAGE 因为都含SDS 差别只在於reducing reagent的有无 SDS可让proteins带负电 但也会破坏non-covalent bond 影响complex及可能影响protein folding 所以non-reducing的proteins也并非在native的状态 (所以称denature) 但部分可以保留住protein的structural epitope供Ab辨识 Non-denaturing electrophoresis: Native condition 也就是所谓的native PAGE 所有dye、buffer都不含2-Me或DTT及SDS [所以sample dye只含有buffer(控制pH)、glycerol(沈降)跟tracing dye] Sample不能煮 Buffer system也不太一样(制胶跟running buffer) 我用过TBE 也看过Tris/Glycine的protocol 不过差异在哪我还不太清楚... 在Native PAGE中 让proteins电泳只靠proteins自己的电性 可以透过protein PI跟调整buffer pH使之带负电以进行电泳 但也因为变因太多(PI、pH、size、shape、complex、interaction等) 所以跟marker比对大多会不准...而且bands可能会很丑...XD PS.如果是棘手的membrane protein想在native下跑电泳 可参考"Blue native PAGE (BN-PAGE)" 以上是我对PAGE的了解 至於Western blotting的部分 只要proteins带负电、可以跑电泳 那一定可以用电转法将proteins transfer到membrane上 (因为原理跟电泳一样啊~XD) SDS-PAGE无论是reducing或non-reducing一定没问题 而native-PAGE则要控制电压、时间、调整buffer等 你如果想做native-PAGE的Western blotting 请google一下 http://tinyurl.com/y39thp3 看完後你会发现... 基本上Western blotting的作法是一样的...XD PS.我不解的是...你文中的意思应该做了两次都有出来 但你老板为什麽只在意有没有SDS...= =a ※ 引述《sjacky (陈小文)》之铭言： : 大家好： : 最近买了一只抗体 Chemicon, Anti-Apolipoprotein H : 在Datasheet http://0rz.tw/n6ZTL 上面有写到non-reducing这个部份 : 问sells的结果他说,在sample buffer的部份不要加入B-me,其他部份都一样 : 依照他的说法,做了两次,结果拿给老板看 : 老板说 non-reducing的话,连SDS都不能加 : 想要请教一下,有没有人有作过的 : 想要请教一下作法跟一般western blotting有什麽差别 : 谢谢 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.94.205 ※ 编辑: Fourfish 来自: 140.116.94.205 (04/10 13:00)