作者relaxsleep (火球連發~)
看板Biotech
標題[求救] pichia pastoris 表現
時間Fri Apr 2 12:06:53 2010
小弟目前已經把目標基因送到P. pastoris GS115
genomic DNA使用PCR去分析已經能有目標BAND出現
但是使用3ml YPD培養24小時
接踵至15ml BMGY mediem in 50ml離心管OD600=0.15
養24小時OD600=3~4
離心換成15ml BMMY medium
24小時後加150ul methanol誘導
隔天24小時後再加150ul methanol誘導
24小時後取上清液跑SDS-PAGE與測活性
但是活性幾乎都沒有SDS-PAGE也沒有BAND出現
請問是誘導失敗嗎??
有哪步驟做錯了嗎@@""
還是要使用有凹底的燒杯去搖?
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.35.106
1F：推 sinDog:有濃縮嗎??? 想想你的表現量與MEDIUM的量的關係!! 04/02 17:34
2F：→ relaxsleep:沒有濃縮耶@@ 要跑column嗎 冏 04/02 23:31
3F：→ relaxsleep:不過正常來說 應該上清液就看的到了吧@@ 04/02 23:56
4F：推 qumai:濃縮1mL medium 跑跑看,搖瓶最好到200 rpm 04/03 02:38
5F：→ relaxsleep:我使用250rpm 請問大大1ml怎濃縮@@?? 04/03 02:45
6F：推 littlelizard:好熟悉的ID阿...我沒聽過有人用離心管養耶 = = 04/03 15:39
7F：→ littlelizard:原po是不是看了最近新發表外國人的影片教學阿 @@ 04/03 15:40
8F：→ littlelizard:我覺得你的OD600很低 是不是通氣不好 菌長不起來 = = 04/03 15:40
10F：→ littlelizard:上面就是我說的影片 其實我覺得有些地方怪怪的 = = 04/03 15:43
11F：→ littlelizard:菌可以這樣養嗎? 看看就好 =3= 04/03 15:43
12F：→ relaxsleep:樓上id也很眼熟XD 我是參考有些paper的protocal 04/03 20:47
13F：→ relaxsleep:可能是通氣不好 影片我不能看耶@@ 要登入的樣子 04/03 20:48
14F：→ relaxsleep:可能改用搖瓶的試試@@ 希望能有表現冏 04/03 20:50
15F：→ relaxsleep:我看完了 他沒用離心管養啦 只是離心XD 他錐形瓶上面蓋 04/03 21:19
16F：→ relaxsleep:燒杯 好特別 可以試看看 04/03 21:20
17F：→ relaxsleep:看完覺得他們實驗室好有錢@@ 都是高級貨~~ 04/03 21:21
18F：推 qumai:用final 10% TCA把protein沉澱下來,再用-20冰過的acetone洗 04/04 14:51
19F：推 littlelizard:我建議你用底部有凹槽的flask養 蓋子用塑膠的那種 04/04 15:58
20F：→ littlelizard:我看過有人用矽膠塞 那個通氣也不好 燒杯我不敢試= = 04/04 15:59
21F：→ littlelizard:如果用3 mL試管養24 h OD600應該可以到30幾 04/04 16:00
22F：→ littlelizard:然後接1~1.5%到100 mL BMGY 04/04 16:01
23F：→ littlelizard:我都搖250~300 rpm 04/04 16:02
24F：→ relaxsleep:我目前是包鋁箔搖 等明天換塑膠塞看看 04/04 20:12
25F：→ relaxsleep:qumai大 沉澱要離心去上清液?acetone洗完用離心嗎?回溶 04/04 20:15
26F：→ relaxsleep:是用? TCA有配方嗎@@" 我沒用過 冏 04/04 20:17
27F：→ qumai:TCA就是三氯醋酸~比光用丙酮沉澱鹽類少,加入TCA之後4度C 04/04 23:14
28F：→ qumai:overnight,離心後再用冰的丙酮洗掉殘留的TCA 04/04 23:15
29F：→ qumai:最後用SDS loading dye 回溶就可以了 04/04 23:15
30F：→ relaxsleep:恩謝謝~~要overnight感覺要做好久XD 04/04 23:25
31F：推 inchew:-20度1~2小時其實也可以。 04/10 03:19
32F：推 inchew:除非表現量非常高的菌株才可以直接跑PAGE看到，建議濃縮。 07/10 04:16