作者relaxsleep (火球连发~)
看板Biotech
标题[求救] pichia pastoris 表现
时间Fri Apr 2 12:06:53 2010
小弟目前已经把目标基因送到P. pastoris GS115
genomic DNA使用PCR去分析已经能有目标BAND出现
但是使用3ml YPD培养24小时
接踵至15ml BMGY mediem in 50ml离心管OD600=0.15
养24小时OD600=3~4
离心换成15ml BMMY medium
24小时後加150ul methanol诱导
隔天24小时後再加150ul methanol诱导
24小时後取上清液跑SDS-PAGE与测活性
但是活性几乎都没有SDS-PAGE也没有BAND出现
请问是诱导失败吗??
有哪步骤做错了吗@@""
还是要使用有凹底的烧杯去摇?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.35.106
1F：推 sinDog:有浓缩吗??? 想想你的表现量与MEDIUM的量的关系!! 04/02 17:34
2F：→ relaxsleep:没有浓缩耶@@ 要跑column吗 冏 04/02 23:31
3F：→ relaxsleep:不过正常来说 应该上清液就看的到了吧@@ 04/02 23:56
4F：推 qumai:浓缩1mL medium 跑跑看,摇瓶最好到200 rpm 04/03 02:38
5F：→ relaxsleep:我使用250rpm 请问大大1ml怎浓缩@@?? 04/03 02:45
6F：推 littlelizard:好熟悉的ID阿...我没听过有人用离心管养耶 = = 04/03 15:39
7F：→ littlelizard:原po是不是看了最近新发表外国人的影片教学阿 @@ 04/03 15:40
8F：→ littlelizard:我觉得你的OD600很低 是不是通气不好 菌长不起来 = = 04/03 15:40
10F：→ littlelizard:上面就是我说的影片 其实我觉得有些地方怪怪的 = = 04/03 15:43
11F：→ littlelizard:菌可以这样养吗? 看看就好 =3= 04/03 15:43
12F：→ relaxsleep:楼上id也很眼熟XD 我是参考有些paper的protocal 04/03 20:47
13F：→ relaxsleep:可能是通气不好 影片我不能看耶@@ 要登入的样子 04/03 20:48
14F：→ relaxsleep:可能改用摇瓶的试试@@ 希望能有表现冏 04/03 20:50
15F：→ relaxsleep:我看完了 他没用离心管养啦 只是离心XD 他锥形瓶上面盖 04/03 21:19
16F：→ relaxsleep:烧杯 好特别 可以试看看 04/03 21:20
17F：→ relaxsleep:看完觉得他们实验室好有钱@@ 都是高级货~~ 04/03 21:21
18F：推 qumai:用final 10% TCA把protein沉淀下来,再用-20冰过的acetone洗 04/04 14:51
19F：推 littlelizard:我建议你用底部有凹槽的flask养 盖子用塑胶的那种 04/04 15:58
20F：→ littlelizard:我看过有人用矽胶塞 那个通气也不好 烧杯我不敢试= = 04/04 15:59
21F：→ littlelizard:如果用3 mL试管养24 h OD600应该可以到30几 04/04 16:00
22F：→ littlelizard:然後接1~1.5%到100 mL BMGY 04/04 16:01
23F：→ littlelizard:我都摇250~300 rpm 04/04 16:02
24F：→ relaxsleep:我目前是包铝箔摇 等明天换塑胶塞看看 04/04 20:12
25F：→ relaxsleep:qumai大 沉淀要离心去上清液?acetone洗完用离心吗?回溶 04/04 20:15
26F：→ relaxsleep:是用? TCA有配方吗@@" 我没用过 冏 04/04 20:17
27F：→ qumai:TCA就是三氯醋酸~比光用丙酮沉淀盐类少,加入TCA之後4度C 04/04 23:14
28F：→ qumai:overnight,离心後再用冰的丙酮洗掉残留的TCA 04/04 23:15
29F：→ qumai:最後用SDS loading dye 回溶就可以了 04/04 23:15
30F：→ relaxsleep:恩谢谢~~要overnight感觉要做好久XD 04/04 23:25
31F：推 inchew:-20度1~2小时其实也可以。 04/10 03:19
32F：推 inchew:除非表现量非常高的菌株才可以直接跑PAGE看到，建议浓缩。 07/10 04:16