作者ftsyice (Matt)
看板Biotech
標題[求救] Western & 細胞膜上的蛋白質
時間Thu Apr 1 15:53:39 2010
這問題困擾我很久了,我想請問大家
平常抽Protein的順序為加入RIPA buffer後,12000RPM,及可跑SDS PAGE
但如果要看其他的膜上蛋白,例如NA/K幫浦,離子通道蛋白等..
是否非得用超高速離心機才可做呢?
小弟研究的主題為Aquaporin 5 (AQP5)
in vitro
使用細胞為A253 (唾液腺體),使用普通的total lysis抽蛋白質後
配合Advance ECL,可以壓出AQP5
in vivo
SD-RAT活體的組織就撞牆了,壓不出AQP5
我想到的可能性有三點
1.)是lysis buffer使用錯誤? (RIPA、HEPES、UREA??)
2.)唾液腺體成份特別,比起其它的組織,抽取蛋白質的方式不一樣?
3.)膜上的蛋白質,得將膜分離出來後,才壓的出來?
(有文獻使用超高速離心,將細胞膜離出後再跑SDS PAGE)
想問有經驗的同行
傳統的total lysis抽不到的膜上特定蛋白.
是否會因為分離出膜後,才能順利壓的到呢?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.14
1F：推 aceliang:亂入一下，A549是唾液腺體??? 04/01 16:18
2F：→ g010377:A549好像是lung carcinoma cell? 04/01 16:43
謝謝提醒,A549是我的control,唾液腺體是A253 Orz
※ 編輯: ftsyice 來自: 210.60.122.14 (04/01 16:51)
3F：推 vandia:NKA一般不用離高速就有,除非你的nka量很少.. 04/01 17:06
4F：→ vandia:我做過NKA,VHA,NKCC,NHE...都只要離2萬g就可以囉.. 04/01 17:07
5F：推 firstfrost:原po我居然認識= = 用Kit啦 砸錢下去吧~~~ 04/01 20:03
6F：推 reinherd:有沒有嘗試過sonication? 可以幫助萃取膜蛋白 04/02 09:38
7F：→ reinherd:我曾經有遇過用ripa抽蛋白壓不出來 但是改用sds抽就壓出 04/02 09:39
8F：→ reinherd:來 我覺得您可以參考看看 04/02 09:39
9F：→ reinherd:我先聲明我做的和你差很多 不一定適用 04/02 09:40
10F：→ vandia:推樓上 我們家就是用sonication 04/02 11:47
11F：推 celestial318:我們家看膜上蛋白也都是用sonication 04/03 02:40
12F：推 hc0122:可能得加protease inhibitor tissue中有很多protease 04/03 17:59