作者ftsyice (Matt)
看板Biotech
标题[求救] Western & 细胞膜上的蛋白质
时间Thu Apr 1 15:53:39 2010
这问题困扰我很久了,我想请问大家
平常抽Protein的顺序为加入RIPA buffer後,12000RPM,及可跑SDS PAGE
但如果要看其他的膜上蛋白,例如NA/K帮浦,离子通道蛋白等..
是否非得用超高速离心机才可做呢?
小弟研究的主题为Aquaporin 5 (AQP5)
in vitro
使用细胞为A253 (唾液腺体),使用普通的total lysis抽蛋白质後
配合Advance ECL,可以压出AQP5
in vivo
SD-RAT活体的组织就撞墙了,压不出AQP5
我想到的可能性有三点
1.)是lysis buffer使用错误? (RIPA、HEPES、UREA??)
2.)唾液腺体成份特别,比起其它的组织,抽取蛋白质的方式不一样?
3.)膜上的蛋白质,得将膜分离出来後,才压的出来?
(有文献使用超高速离心,将细胞膜离出後再跑SDS PAGE)
想问有经验的同行
传统的total lysis抽不到的膜上特定蛋白.
是否会因为分离出膜後,才能顺利压的到呢?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.14
1F：推 aceliang:乱入一下，A549是唾液腺体??? 04/01 16:18
2F：→ g010377:A549好像是lung carcinoma cell? 04/01 16:43
谢谢提醒,A549是我的control,唾液腺体是A253 Orz
※ 编辑: ftsyice 来自: 210.60.122.14 (04/01 16:51)
3F：推 vandia:NKA一般不用离高速就有,除非你的nka量很少.. 04/01 17:06
4F：→ vandia:我做过NKA,VHA,NKCC,NHE...都只要离2万g就可以罗.. 04/01 17:07
5F：推 firstfrost:原po我居然认识= = 用Kit啦 砸钱下去吧~~~ 04/01 20:03
6F：推 reinherd:有没有尝试过sonication? 可以帮助萃取膜蛋白 04/02 09:38
7F：→ reinherd:我曾经有遇过用ripa抽蛋白压不出来 但是改用sds抽就压出 04/02 09:39
8F：→ reinherd:来 我觉得您可以参考看看 04/02 09:39
9F：→ reinherd:我先声明我做的和你差很多 不一定适用 04/02 09:40
10F：→ vandia:推楼上 我们家就是用sonication 04/02 11:47
11F：推 celestial318:我们家看膜上蛋白也都是用sonication 04/03 02:40
12F：推 hc0122:可能得加protease inhibitor tissue中有很多protease 04/03 17:59