作者blueashin (tRoMboNe pLaYer)
看板Biotech
標題[求救] 有關gel extraction
時間Mon Mar 29 14:38:22 2010
想請教板上的各位先進
最近我有一條基因想要送讀序
可是一直無法以gel extraction的方式成功回收
但是因為pcr的產物 量實在是無法增加
所以只能在gel extraction方面加強
以下是我gel extraction的步驟:我使用的是V牌國產的回收kit
切下膠塊以500ul GEX buffer回溶
60 度C加熱10分鐘 反轉2-3次
通入column用vocume method
WN buffer500ul
WS buffer 500ul
13000rpm 25度c離心3分鐘
加入預熱60度C之EB或者 ddH2O(pH=7)
等待10分鐘
13000rpm 25度C離心3分鐘
以上步驟 不知道到底是哪理出問題了QQ還是說是他們的column有問題?
我測OD值都很低 有時候還測不到東西
縱使有測到 A260/230的值也很低
要做ligation實在有困難QQ
以上 懇請各位指教~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.241.123.131
1F：推 singren:不用做gel extraction也可以送定序吧..廠商好像會幫你做~ 03/29 15:28
2F：→ singren:需要的話在跟廠商要sample也可以呀~ 03/29 15:29
3F：推 tinapig:承1F說的,可以拿PCR產物純化後送定序,但有些老闆(師)不喜 03/29 16:57
4F：→ tinapig:to原po:60度融解gel後,是否有先冷卻(至室溫)?有時若膠太大 03/29 17:00
5F：→ tinapig:在60度全融,但回到室溫會又有點凝固,這樣回收率會很差~ 03/29 17:00
6F：→ tinapig:以上是我以前遇到的狀況~請加油:) 03/29 17:01
7F：推 oh:treat exonulease I跟SAP~就可以直接送定序~ 03/29 17:22
8F：→ oh: 打錯是 exonuclease I 03/29 17:25
9F：→ chaunen:不能一次P個好幾管 再去切交純化嗎@.@? 03/29 21:40
10F：→ chaunen:我都是加熱30sec invert30sec 直到溶解 就放著等他涼 03/29 21:41
11F：→ chaunen:可以的話用越少agarose越好 (1% LM agarose 真的很嫩=.=) 03/29 21:42
12F：→ chaunen:沒看清楚原文, 直接拿PCR產物去定序就好了吧? 03/29 21:44
13F：→ chaunen:不過這也只保證primer後的50bp~700bp 是可信的 03/29 21:45
14F：→ chaunen:如果想要整個完整定序到的話, PCR產物直接接到T/A 03/29 21:47
15F：→ chaunen:再抽plasmid去定序? 03/29 21:47
16F：→ ksn:檢視一下protocol，WS buffer有無加入酒精，WS buff 離心完後 03/29 22:52
17F：→ ksn:需要不加buffer全速空轉三分鐘去除WS的酒精成分 03/29 22:54
18F：→ ksn:膠不要超過2%，總重在200mg較佳。切膠是盲切還是在X光台下? 03/29 22:55
19F：→ ksn:我昏頭了XD 我是指UV光台 XD 03/29 22:56
20F：→ ksn:預熱60度C回收大於5k片段時利用，小片段使用一般水2~3min即可 03/29 23:00
21F：→ blueashin:喔喔喔 沒想到大家這麼熱心(感動中)請受小弟一拜~ 03/30 01:26
22F：→ blueashin:各位說的 我會注意看看~感恩感恩有任何消息我會回報~ 03/30 01:26
23F：→ blueashin:還有就是 因為我是做RACE-pcr所以 非單一產物 03/30 01:28
24F：→ blueashin:所以要直接送 PCR產物可能不行QQ 03/30 01:28
25F：→ blueashin:不過真的很感謝各位熱心的回應~感恩感恩 03/30 01:29
26F：→ blueashin:切膠是在UV box上面切的 03/30 01:31
27F：推 vetvet:如果是single band用Q牌的PCR purification kit吧!回收量差 04/10 15:02
28F：→ vetvet:很多 04/10 15:02