作者blueashin (tRoMboNe pLaYer)
看板Biotech
标题[求救] 有关gel extraction
时间Mon Mar 29 14:38:22 2010
想请教板上的各位先进
最近我有一条基因想要送读序
可是一直无法以gel extraction的方式成功回收
但是因为pcr的产物 量实在是无法增加
所以只能在gel extraction方面加强
以下是我gel extraction的步骤:我使用的是V牌国产的回收kit
切下胶块以500ul GEX buffer回溶
60 度C加热10分钟 反转2-3次
通入column用vocume method
WN buffer500ul
WS buffer 500ul
13000rpm 25度c离心3分钟
加入预热60度C之EB或者 ddH2O(pH=7)
等待10分钟
13000rpm 25度C离心3分钟
以上步骤 不知道到底是哪理出问题了QQ还是说是他们的column有问题?
我测OD值都很低 有时候还测不到东西
纵使有测到 A260/230的值也很低
要做ligation实在有困难QQ
以上 恳请各位指教~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.241.123.131
1F：推 singren:不用做gel extraction也可以送定序吧..厂商好像会帮你做~ 03/29 15:28
2F：→ singren:需要的话在跟厂商要sample也可以呀~ 03/29 15:29
3F：推 tinapig:承1F说的,可以拿PCR产物纯化後送定序,但有些老板(师)不喜 03/29 16:57
4F：→ tinapig:to原po:60度融解gel後,是否有先冷却(至室温)?有时若胶太大 03/29 17:00
5F：→ tinapig:在60度全融,但回到室温会又有点凝固,这样回收率会很差~ 03/29 17:00
6F：→ tinapig:以上是我以前遇到的状况~请加油:) 03/29 17:01
7F：推 oh:treat exonulease I跟SAP~就可以直接送定序~ 03/29 17:22
8F：→ oh: 打错是 exonuclease I 03/29 17:25
9F：→ chaunen:不能一次P个好几管 再去切交纯化吗@.@? 03/29 21:40
10F：→ chaunen:我都是加热30sec invert30sec 直到溶解 就放着等他凉 03/29 21:41
11F：→ chaunen:可以的话用越少agarose越好 (1% LM agarose 真的很嫩=.=) 03/29 21:42
12F：→ chaunen:没看清楚原文, 直接拿PCR产物去定序就好了吧? 03/29 21:44
13F：→ chaunen:不过这也只保证primer後的50bp~700bp 是可信的 03/29 21:45
14F：→ chaunen:如果想要整个完整定序到的话, PCR产物直接接到T/A 03/29 21:47
15F：→ chaunen:再抽plasmid去定序? 03/29 21:47
16F：→ ksn:检视一下protocol，WS buffer有无加入酒精，WS buff 离心完後 03/29 22:52
17F：→ ksn:需要不加buffer全速空转三分钟去除WS的酒精成分 03/29 22:54
18F：→ ksn:胶不要超过2%，总重在200mg较佳。切胶是盲切还是在X光台下? 03/29 22:55
19F：→ ksn:我昏头了XD 我是指UV光台 XD 03/29 22:56
20F：→ ksn:预热60度C回收大於5k片段时利用，小片段使用一般水2~3min即可 03/29 23:00
21F：→ blueashin:喔喔喔 没想到大家这麽热心(感动中)请受小弟一拜~ 03/30 01:26
22F：→ blueashin:各位说的 我会注意看看~感恩感恩有任何消息我会回报~ 03/30 01:26
23F：→ blueashin:还有就是 因为我是做RACE-pcr所以 非单一产物 03/30 01:28
24F：→ blueashin:所以要直接送 PCR产物可能不行QQ 03/30 01:28
25F：→ blueashin:不过真的很感谢各位热心的回应~感恩感恩 03/30 01:29
26F：→ blueashin:切胶是在UV box上面切的 03/30 01:31
27F：推 vetvet:如果是single band用Q牌的PCR purification kit吧!回收量差 04/10 15:02
28F：→ vetvet:很多 04/10 15:02