※ 引述《ricebaby (小蘋兒)》之銘言 : 請問各位 : 小妹我目前準備要構築一個質體 : 含有分別為700bp與1.4K片段的insert(抗體的light chain&heavy chain) : 要送入pET20b作蛋白質表現 : 但首先我必須先利用PCR將這兩段原本接在pEGFP-N1的insert P出來 : 請問各位我該如何設計primer呢 : 目前我想到的是 : 1.restriction enzyme site-(NdeI)--insert1---restriction enzyme site(EcoRV) : 2.restriction enzyme site-(EcoEV)--insert2---restriction enzyme site(XhoI) : 因為我對了pET20b 的sequence map ,restriction Enzyme site有inframe的只有 : EcoRV&NotI&XhoI : 所以選擇了EcoRV不知道這樣設計對不對 ?? : 然後就利用PCR將兩個片段分別P出來 之後我想到的作法有兩種 想請問大家的意見 : 1.將PCR P出來的兩個片段分別送到pET20b-->挑clone-->送定序 : -->再利用EcoRV 將兩個plasmid各切一刀-->ligation-->transformation-->挑clone ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 不可行 質體最後會self-ligation--->這個不是你要的 vector-insert1-EcoRV-insert2-vector --->這個應該是你的理想形式吧， 但會有兩個ori，不可能轉形成功 不過可以賭賭看成功率，就是你的ligation產物，假使剛好insert1-EcoRV-insert2有成 你可以直接ligation產物作PCR(insert1 forword primer & insert2 reverse primer) 但我覺得失敗率挺高的.....（好像跟你第二個方法有像到） : -->定序 : 2.將PCR P出來的兩個片段先利用EcoEV切一刀-->ligation : -->用原本insert1的forward primer-NdeI&insert2的reverse primer-XhoI進行PCR : 將合成的片段放大-->Enzyme digestion(NdeI&XhoI)-->ligation送入pET20b--> : transformation-->挑clone-->sequencing 這個比我剛剛的提議成功率高 不過記得設計的切點旁邊要空幾個mer : 請問各位以上兩個方法可以行的通嗎?可以幫我分析一下優缺點嗎? : 還有其他該注意的事項嗎? : 感謝各位 --

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