※ 引述《ricebaby (小苹儿)》之铭言 : 请问各位 : 小妹我目前准备要构筑一个质体 : 含有分别为700bp与1.4K片段的insert(抗体的light chain&heavy chain) : 要送入pET20b作蛋白质表现 : 但首先我必须先利用PCR将这两段原本接在pEGFP-N1的insert P出来 : 请问各位我该如何设计primer呢 : 目前我想到的是 : 1.restriction enzyme site-(NdeI)--insert1---restriction enzyme site(EcoRV) : 2.restriction enzyme site-(EcoEV)--insert2---restriction enzyme site(XhoI) : 因为我对了pET20b 的sequence map ,restriction Enzyme site有inframe的只有 : EcoRV&NotI&XhoI : 所以选择了EcoRV不知道这样设计对不对 ?? : 然後就利用PCR将两个片段分别P出来 之後我想到的作法有两种 想请问大家的意见 : 1.将PCR P出来的两个片段分别送到pET20b-->挑clone-->送定序 : -->再利用EcoRV 将两个plasmid各切一刀-->ligation-->transformation-->挑clone ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 不可行 质体最後会self-ligation--->这个不是你要的 vector-insert1-EcoRV-insert2-vector --->这个应该是你的理想形式吧， 但会有两个ori，不可能转形成功 不过可以赌赌看成功率，就是你的ligation产物，假使刚好insert1-EcoRV-insert2有成 你可以直接ligation产物作PCR(insert1 forword primer & insert2 reverse primer) 但我觉得失败率挺高的.....（好像跟你第二个方法有像到） : -->定序 : 2.将PCR P出来的两个片段先利用EcoEV切一刀-->ligation : -->用原本insert1的forward primer-NdeI&insert2的reverse primer-XhoI进行PCR : 将合成的片段放大-->Enzyme digestion(NdeI&XhoI)-->ligation送入pET20b--> : transformation-->挑clone-->sequencing 这个比我刚刚的提议成功率高 不过记得设计的切点旁边要空几个mer : 请问各位以上两个方法可以行的通吗?可以帮我分析一下优缺点吗? : 还有其他该注意的事项吗? : 感谢各位 --

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