作者dodomilk (豆漿)
看板Biotech
標題[求救] 請問將一段基因放入vector
時間Sun Mar 28 01:50:17 2010
各位好，我現在在化學實驗室工作，沒有分生專長的學長姐可以問
所以想請大家幫忙
我現在想在一個7k bp的E.coli vector中插入一段約60 bp的序列
大概是長這樣 ----T7 promotor-----intein---target protein-----
↑
插在這裡
intein是作為affinity column純化時使用，約50kD的protein
原本的MCS在intein的下游，但在插入target protein時已經用掉
那麼我該怎麼把60 bp插到promotor和intein的中間呢？
目前想到的大概是
用Site-directed mutagenesis在想插入60 bp的地方，
先插入兩種restriction site，約12或15 bp，再用ligase接上去。
不過不曉得Site-directed mutagenesis有沒有辦法直接插入60 bp呢？
另外，我們手頭上其實沒有這60 bp的DNA，應該要怎麼製作出來呢？
我猜大概可以先請別人合成60 bp的RNA，再用RT-PCR作出DNA...這樣做可行嗎？
原PO非專家，兩個簡單問題請教大家
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◆ From: 123.195.2.120
1F：推 DJHINN:直接和成 DNA就好了 = = 03/31 14:21
2F：→ DJHINN:60bp PCR做不出來 RT也有點浪費 且我也懷疑做不出來 03/31 14:22
3F：→ DJHINN:找 和成引子的 公司 跟她說 你要合成 一段 60bp的引子 03/31 14:22
4F：→ DJHINN:拿到之後 做a-tailing的實驗 在頭尾 +A 03/31 14:23
5F：→ DJHINN:方便你insert進 VECTOR 03/31 14:23
6F：→ DJHINN:另外 你的vector是自備的嗎? 還是 商業的 03/31 14:24
7F：→ DJHINN:看起來應該是自備的，60bp : 6000 bP我覺得不好塞 這方面 03/31 14:25
8F：→ DJHINN:可能要嘗試多次一點 03/31 14:25
9F：→ DJHINN:你用限制酶切下來的片段，可能要用到3%左右的膠跑看看 03/31 14:26
10F：推 DJHINN:關於 insert部分 我好像有點弄錯了 因為我把它當成一般 03/31 14:37
11F：→ DJHINN:commercial 的 TA clone vector了 那部分 ....就算了吧 03/31 14:37