作者dodomilk (豆浆)
看板Biotech
标题[求救] 请问将一段基因放入vector
时间Sun Mar 28 01:50:17 2010
各位好，我现在在化学实验室工作，没有分生专长的学长姐可以问
所以想请大家帮忙
我现在想在一个7k bp的E.coli vector中插入一段约60 bp的序列
大概是长这样 ----T7 promotor-----intein---target protein-----
↑
插在这里
intein是作为affinity column纯化时使用，约50kD的protein
原本的MCS在intein的下游，但在插入target protein时已经用掉
那麽我该怎麽把60 bp插到promotor和intein的中间呢？
目前想到的大概是
用Site-directed mutagenesis在想插入60 bp的地方，
先插入两种restriction site，约12或15 bp，再用ligase接上去。
不过不晓得Site-directed mutagenesis有没有办法直接插入60 bp呢？
另外，我们手头上其实没有这60 bp的DNA，应该要怎麽制作出来呢？
我猜大概可以先请别人合成60 bp的RNA，再用RT-PCR作出DNA...这样做可行吗？
原PO非专家，两个简单问题请教大家
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 123.195.2.120
1F：推 DJHINN:直接和成 DNA就好了 = = 03/31 14:21
2F：→ DJHINN:60bp PCR做不出来 RT也有点浪费 且我也怀疑做不出来 03/31 14:22
3F：→ DJHINN:找 和成引子的 公司 跟她说 你要合成 一段 60bp的引子 03/31 14:22
4F：→ DJHINN:拿到之後 做a-tailing的实验 在头尾 +A 03/31 14:23
5F：→ DJHINN:方便你insert进 VECTOR 03/31 14:23
6F：→ DJHINN:另外 你的vector是自备的吗? 还是 商业的 03/31 14:24
7F：→ DJHINN:看起来应该是自备的，60bp : 6000 bP我觉得不好塞 这方面 03/31 14:25
8F：→ DJHINN:可能要尝试多次一点 03/31 14:25
9F：→ DJHINN:你用限制酶切下来的片段，可能要用到3%左右的胶跑看看 03/31 14:26
10F：推 DJHINN:关於 insert部分 我好像有点弄错了 因为我把它当成一般 03/31 14:37
11F：→ DJHINN:commercial 的 TA clone vector了 那部分 ....就算了吧 03/31 14:37