作者childchen ( 戒!!!)
看板Biotech
標題Re: [求救] PCR 一直有雜band
時間Fri Mar 26 22:40:02 2010
※ 引述《ricebaby (小蘋兒)》之銘言：
: 請問大家小妹我現在作的PCR產物除了我要的major band之外一直都有其他的雜band
: PCR 的反應試料為
: DNA(100ng/ul)--1ul
: Forward primer(10mM)--2.5ul
: reverse primer(10mM)--2.5ul
: 10x pfu buffer----5ul
: pfu polymerase---0.5ul
: ddH2O---37.5ul
: Total volum 50ul
: 我用的PCR條件是
: 94度 2min
: 94度 30s,
: (gradient:60&63&65度)30s,
: 72度 1min
: 72度 10min
: 35 cycle
: 預計要夾出的片段為702bp
: 但是跑出來的位置在700上下有兩條緊緊黏在一起的兩條band
: 做了Gel elute(是用2%的gel) 還是一樣><
: 請問大家該怎麼辦呢><
: 感謝大家
關於這個問題有幾種可能：
(1) 妳設計的Primer專一性不高。
(2) 妳所用的reagent有contamination
解決方法：非reagent的問題
(1) 利用Touch-down PCR的方式，提高專一性，先在annealing的時候，
跑比原本的Tm值高的溫度，例如：Tm=58度的話，妳可以先設62度
跑個10~15個cycle，再隨著每一個cycle數，逐漸降低溫度，跑完整個PCR實驗。
(2) 你用2 % gel，可以用50V左右，跑個60~80分鐘，甚至更低的伏特跑更久，
盡可能使Band分開，再利用gel extraction，進行定序，說不定是個isoform。
這是目前我想到的解決方法~
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◆ From: 59.113.101.32
1F：推 leoblack:touchdown是先低溫(先求有)再高溫(再求好)吧~ 03/27 02:42
2F：→ childchen:我做的是先高後低耶~先求高專一性再放大 03/27 06:55
3F：推 leoblack:對不起~是我搞錯了~我說的方法是屬於booster PCR的改良版 03/27 11:05
4F：推 relaxsleep:我使用的pfu,Elongation溫度為68度耶 是每一家不同嗎XD 03/30 10:06