作者childchen ( 戒!!!)
看板Biotech
标题Re: [求救] PCR 一直有杂band
时间Fri Mar 26 22:40:02 2010
※ 引述《ricebaby (小苹儿)》之铭言：
: 请问大家小妹我现在作的PCR产物除了我要的major band之外一直都有其他的杂band
: PCR 的反应试料为
: DNA(100ng/ul)--1ul
: Forward primer(10mM)--2.5ul
: reverse primer(10mM)--2.5ul
: 10x pfu buffer----5ul
: pfu polymerase---0.5ul
: ddH2O---37.5ul
: Total volum 50ul
: 我用的PCR条件是
: 94度 2min
: 94度 30s,
: (gradient:60&63&65度)30s,
: 72度 1min
: 72度 10min
: 35 cycle
: 预计要夹出的片段为702bp
: 但是跑出来的位置在700上下有两条紧紧黏在一起的两条band
: 做了Gel elute(是用2%的gel) 还是一样><
: 请问大家该怎麽办呢><
: 感谢大家
关於这个问题有几种可能：
(1) 你设计的Primer专一性不高。
(2) 你所用的reagent有contamination
解决方法：非reagent的问题
(1) 利用Touch-down PCR的方式，提高专一性，先在annealing的时候，
跑比原本的Tm值高的温度，例如：Tm=58度的话，你可以先设62度
跑个10~15个cycle，再随着每一个cycle数，逐渐降低温度，跑完整个PCR实验。
(2) 你用2 % gel，可以用50V左右，跑个60~80分钟，甚至更低的伏特跑更久，
尽可能使Band分开，再利用gel extraction，进行定序，说不定是个isoform。
这是目前我想到的解决方法~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 59.113.101.32
1F：推 leoblack:touchdown是先低温(先求有)再高温(再求好)吧~ 03/27 02:42
2F：→ childchen:我做的是先高後低耶~先求高专一性再放大 03/27 06:55
3F：推 leoblack:对不起~是我搞错了~我说的方法是属於booster PCR的改良版 03/27 11:05
4F：推 relaxsleep:我使用的pfu,Elongation温度为68度耶 是每一家不同吗XD 03/30 10:06