作者takkyu (心情真好~)
看板Biotech
標題[求救] BrdU螢光雙染
時間Fri Mar 26 10:47:10 2010
各位板友好，我目前在嘗試BrdU螢光雙染，但是一直不是很成功。
以下是我的方法，想請各位指點。
SD-rat brain section、厚度8um、free-floating的染色方式。
所使用的一抗、二抗分別為：
mouse anti-BrdU (Sigma-Aldrich, B2531, 1:250)
mouse anti-NeuN (Chemicon, MAB377, 1:500)
Hoechst33258 (Vector)
Alexa Fluor goat x mouse 488 & 594 (Invitrogen, 1:500)
染色步驟如下：
1. PBSTx2, PBSx1 各五分鐘
2. 3% H2O2 in PBS 20分鐘 --> PBSx2 各十分鐘
3. 10% NGS + 1% TritonX-100 + 1% BSA + PBS blocking 1hr
4. 1st Ab + 2% NGS + 0.2% TritonX-100 + PBS 4度 overnight
5. PBSx2 各五分鐘
6. 2nd Ab + 2% NGS + 0,2% TritonX-100 + PBS 2hr
7. PBSx2 --> Hoechst33258 10分鐘 --> PBSx2
8. 8% paraformaldehyde 15分鐘 --> PBSTx2, PBSx1各五分鐘
9. 2N HCl in PBS 45度 30分鐘 --> 0.1M borate bufferx2 各十分鐘
10. 5% NGS + diluent (1% BSA + 0.5% Tween20 + 0.1% sodium azide + PBS)
37度 15分鐘
11. BrdU 1st Ab + diluent 37度 兩小時
12. PBSx2, 各五分鐘 --> 撈片 --> anti-fade
ps. 8% paraformaldehyde的方法主要參考這篇文章
Journal of Neuroscience Methods 115 (2002) 97-105
BrdU的染色方法則照Sigma-Aldrich所提供的datasheet
目前的結果往往是NeuN有signal但其他兩者沒有或者是NeuN和Hoechst沒有signal，
而BrdU的signal亦很微弱，想請教各位改善的方式，謝謝板友~
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◆ From: 120.126.97.10
1F：→ vandia:這隻BrdU印象中要在濃一點喔,試試看用1:100 03/26 18:54
2F：→ takkyu:恩恩 我會再試試看 03/31 21:54
3F：→ takkyu:我另外有跟別家實驗室要到protocal~成功後再分享 03/31 21:54