作者takkyu (心情真好~)
看板Biotech
标题[求救] BrdU萤光双染
时间Fri Mar 26 10:47:10 2010
各位板友好，我目前在尝试BrdU萤光双染，但是一直不是很成功。
以下是我的方法，想请各位指点。
SD-rat brain section、厚度8um、free-floating的染色方式。
所使用的一抗、二抗分别为：
mouse anti-BrdU (Sigma-Aldrich, B2531, 1:250)
mouse anti-NeuN (Chemicon, MAB377, 1:500)
Hoechst33258 (Vector)
Alexa Fluor goat x mouse 488 & 594 (Invitrogen, 1:500)
染色步骤如下：
1. PBSTx2, PBSx1 各五分钟
2. 3% H2O2 in PBS 20分钟 --> PBSx2 各十分钟
3. 10% NGS + 1% TritonX-100 + 1% BSA + PBS blocking 1hr
4. 1st Ab + 2% NGS + 0.2% TritonX-100 + PBS 4度 overnight
5. PBSx2 各五分钟
6. 2nd Ab + 2% NGS + 0,2% TritonX-100 + PBS 2hr
7. PBSx2 --> Hoechst33258 10分钟 --> PBSx2
8. 8% paraformaldehyde 15分钟 --> PBSTx2, PBSx1各五分钟
9. 2N HCl in PBS 45度 30分钟 --> 0.1M borate bufferx2 各十分钟
10. 5% NGS + diluent (1% BSA + 0.5% Tween20 + 0.1% sodium azide + PBS)
37度 15分钟
11. BrdU 1st Ab + diluent 37度 两小时
12. PBSx2, 各五分钟 --> 捞片 --> anti-fade
ps. 8% paraformaldehyde的方法主要参考这篇文章
Journal of Neuroscience Methods 115 (2002) 97-105
BrdU的染色方法则照Sigma-Aldrich所提供的datasheet
目前的结果往往是NeuN有signal但其他两者没有或者是NeuN和Hoechst没有signal，
而BrdU的signal亦很微弱，想请教各位改善的方式，谢谢板友~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.97.10
1F：→ vandia:这只BrdU印象中要在浓一点喔,试试看用1:100 03/26 18:54
2F：→ takkyu:恩恩 我会再试试看 03/31 21:54
3F：→ takkyu:我另外有跟别家实验室要到protocal~成功後再分享 03/31 21:54