作者absentee (認真打拼最實際!!N Ｉ
看板Biotech
標題[求救] 想請問ChIP assay的PCR定量問題
時間Tue Mar 23 12:29:46 2010
最近開始進行ChIP assay後發生了一點小問題想請大家幫忙...
實驗材料：Millipore ChIP assay Kit
實驗步驟：參照實驗廠商的實驗步驟，起始細胞數每組都為1*10^6，DNA回溶體積為50ul
實驗問題：我實驗分為3組，分別如下...
Mock組(Beads only)
IgG crtl組(4ug rabbit IgG)
Target protein組(4ug Ab)
實驗進行到最後PCR確認時卻發現，在Mock與IgG組也會出現band，但是強度
比Target protein組來得弱，Taget protein組的訊號約是Mock與IgG組的3倍
左右。
PCR條件如下：(反應體積為25ul)
Primer(F)(50mM)：0.5ul
Primer(R)(50mM)：0.5ul
10X Taq buffer：2ul
2.5mM dNTP：1.6ul
Taq：0.08ul
Temp：5ul
ddH2O：16ul
PCR條件：94度，5min / 94度，30s / 60度，30s / 72度，30s / 72度，7min，
/ 4度，oo (30，33，35cycle都試過)
有幾個問題：
1. 我想請問大家是否在控制組的部份也會有band，如果有這個問題大家會如何
解決? 我已嚐試過的方式有降低cycle數，增加wash時間與次數，更換不同廠
牌的IgG(有大幅降低band的訊號但還是有)。
2. 所有組別都是以50ul的體積回溶的話，各組的DNA含量應當不同，那是否在進
行最後的PCR前能夠定量加入的Temp濃度呢，大家會用什麼方式做呢?
謝謝大家~~~小弟告退^^
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.63
1F：推 bb89233:有做preclear? IgG加1ug就好了1ug很強了說 03/23 17:11
2F：→ bb89233:不行定量 那是跟antibody binding的強度有關..定量 03/23 17:12
3F：→ bb89233:就有點modified了.. 03/23 17:13
4F：推 porker:據我所知，控制組應該也是會有band出來，"應該"要比較弱 03/23 22:48
5F：→ porker:control跟實驗組差別愈大愈好，這得抓一下條件... 03/23 22:48
6F：→ porker:你的調整方向應該是對的。 millipore應該是用離心的吧? 03/23 22:49
7F：→ porker:離心的方式好像control會高一點...磁珠分離效果好像比較好 03/23 22:51
8F：→ absentee:Preclear有利用beads做了 我先用1ug的IgG再做看看 感恩^^ 03/24 14:02
9F：→ absentee:磁珠分離是較好的方式 哈哈~不過還是只能先用省錢的方式 03/24 14:03