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标题[求救] 想请问ChIP assay的PCR定量问题
时间Tue Mar 23 12:29:46 2010
最近开始进行ChIP assay後发生了一点小问题想请大家帮忙...
实验材料：Millipore ChIP assay Kit
实验步骤：参照实验厂商的实验步骤，起始细胞数每组都为1*10^6，DNA回溶体积为50ul
实验问题：我实验分为3组，分别如下...
Mock组(Beads only)
IgG crtl组(4ug rabbit IgG)
Target protein组(4ug Ab)
实验进行到最後PCR确认时却发现，在Mock与IgG组也会出现band，但是强度
比Target protein组来得弱，Taget protein组的讯号约是Mock与IgG组的3倍
左右。
PCR条件如下：(反应体积为25ul)
Primer(F)(50mM)：0.5ul
Primer(R)(50mM)：0.5ul
10X Taq buffer：2ul
2.5mM dNTP：1.6ul
Taq：0.08ul
Temp：5ul
ddH2O：16ul
PCR条件：94度，5min / 94度，30s / 60度，30s / 72度，30s / 72度，7min，
/ 4度，oo (30，33，35cycle都试过)
有几个问题：
1. 我想请问大家是否在控制组的部份也会有band，如果有这个问题大家会如何
解决? 我已嚐试过的方式有降低cycle数，增加wash时间与次数，更换不同厂
牌的IgG(有大幅降低band的讯号但还是有)。
2. 所有组别都是以50ul的体积回溶的话，各组的DNA含量应当不同，那是否在进
行最後的PCR前能够定量加入的Temp浓度呢，大家会用什麽方式做呢?
谢谢大家~~~小弟告退^^
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.63
1F：推 bb89233:有做preclear? IgG加1ug就好了1ug很强了说 03/23 17:11
2F：→ bb89233:不行定量 那是跟antibody binding的强度有关..定量 03/23 17:12
3F：→ bb89233:就有点modified了.. 03/23 17:13
4F：推 porker:据我所知，控制组应该也是会有band出来，"应该"要比较弱 03/23 22:48
5F：→ porker:control跟实验组差别愈大愈好，这得抓一下条件... 03/23 22:48
6F：→ porker:你的调整方向应该是对的。 millipore应该是用离心的吧? 03/23 22:49
7F：→ porker:离心的方式好像control会高一点...磁珠分离效果好像比较好 03/23 22:51
8F：→ absentee:Preclear有利用beads做了 我先用1ug的IgG再做看看 感恩^^ 03/24 14:02
9F：→ absentee:磁珠分离是较好的方式 哈哈~不过还是只能先用省钱的方式 03/24 14:03