作者hellheavn (蒼天落日)
看板Biotech
標題[求救] pichia pastoris GS115 transformation做不出來 (慌)
時間Mon Mar 22 01:40:03 2010
製作Pichia Pastoris GS115勝任細胞
1. GS115劃盤(使用YPD固態培養基)，置30℃培養箱培養兩天。
2. 將培養兩天的YPD固態培養基挑取單株菌至含有2mL YPD的試管， 以245rpm、30℃
11小時。
3. 將培養11小時的菌液取95uL接種到含有95mL YPD的搖瓶，以250rpm、30℃培養至OD
1.3(培養至26小時OD600=1.39)。
4. 將搖瓶置於冰上，冰10分鐘。
5. 取一無菌的50mL離心試管，將95mL菌液分裝置此離心管，以4℃離心機回收菌塊
(1500rpm、5min)
6. 以50mL的冰無菌水加入離心管將菌塊回溶，再將離心管，以4℃離心機離心
(1500rpm、5min)，去除上清液(以autopipette小心吸取上清液)，留下菌塊
7. 重覆步驟6. 兩次
8. 以10mL的冰1M sorbitol加入離心管將菌塊回溶
9. 再將離心管，以4℃離心機離心(離心條件:1500rpm、5min)，去除上清液(以autopi
小心吸取上清液)，留下菌塊
10.以400uL的冰1M sorbitol加入離心管將菌塊回溶
11.分裝勝任細胞每管80uL。
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電穿孔轉殖至Pichia Pastoris GS115
1. 將預先以Bgl II酵素剪切成線性的質體取5uL(15ug)加至80uL的勝任細胞。
2. 將混合好的質體及勝任細胞轉至0.2cm的cuvette(小心加入，避免氣泡產生)，並置
上冰鎮5分鐘。
3. 快速擦乾cuvette表面水份，進行電轉殖
電轉條件：
A組:1700kv、25uF、329Ω、8.2 mSec
B組:1500kv、25uF、329Ω、8.2 mSec
4. 電完後馬上打開cuvette蓋子加入1mL的冰YPDS，然後插在冰上冰三分鐘
5. 將cuvette中的菌液轉至15mL乾淨試管中
6. 將試管拿去30℃培養箱以250rpm培養2小時
7. 自培養2小時的試管取50uL及200uL菌液，塗盤於YPDS/Zeocin的固態培養基，以30度
培養3至10天
*問題就出在這裡了,不知道是質體量不夠,還是酵母菌出問題,還是哪個步驟有細節沒注意
酵母菌不長就是不長,所以想請問各位版友指正,小弟感激您
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如來 那這么遠的路，你們是怎么娛樂的？
★唐僧師徒 打怪升級
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◆ From: 114.35.131.185
1F：推 molkna:可以提高PLASMID的濃度到30~50ug不等，另外塗盤時zeocin 03/22 13:35
2F：→ molkna:的濃度是多少?可以先用zeocin100試試，有長再換到高濃度的 03/22 13:36
3F：→ molkna:步驟六我的方法是靜置培養箱中，每15分鐘震盪一次 03/22 13:37
4F：→ molkna:還有電完後我是加1ml 的1M sorbitol，你可以參考看看 03/22 13:38
5F：→ hellheavn:zeocin 100ug/mL 03/22 20:20