作者hellheavn (苍天落日)
看板Biotech
标题[求救] pichia pastoris GS115 transformation做不出来 (慌)
时间Mon Mar 22 01:40:03 2010
制作Pichia Pastoris GS115胜任细胞
1. GS115划盘(使用YPD固态培养基)，置30℃培养箱培养两天。
2. 将培养两天的YPD固态培养基挑取单株菌至含有2mL YPD的试管， 以245rpm、30℃
11小时。
3. 将培养11小时的菌液取95uL接种到含有95mL YPD的摇瓶，以250rpm、30℃培养至OD
1.3(培养至26小时OD600=1.39)。
4. 将摇瓶置於冰上，冰10分钟。
5. 取一无菌的50mL离心试管，将95mL菌液分装置此离心管，以4℃离心机回收菌块
(1500rpm、5min)
6. 以50mL的冰无菌水加入离心管将菌块回溶，再将离心管，以4℃离心机离心
(1500rpm、5min)，去除上清液(以autopipette小心吸取上清液)，留下菌块
7. 重覆步骤6. 两次
8. 以10mL的冰1M sorbitol加入离心管将菌块回溶
9. 再将离心管，以4℃离心机离心(离心条件:1500rpm、5min)，去除上清液(以autopi
小心吸取上清液)，留下菌块
10.以400uL的冰1M sorbitol加入离心管将菌块回溶
11.分装胜任细胞每管80uL。
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电穿孔转殖至Pichia Pastoris GS115
1. 将预先以Bgl II酵素剪切成线性的质体取5uL(15ug)加至80uL的胜任细胞。
2. 将混合好的质体及胜任细胞转至0.2cm的cuvette(小心加入，避免气泡产生)，并置
上冰镇5分钟。
3. 快速擦乾cuvette表面水份，进行电转殖
电转条件：
A组:1700kv、25uF、329Ω、8.2 mSec
B组:1500kv、25uF、329Ω、8.2 mSec
4. 电完後马上打开cuvette盖子加入1mL的冰YPDS，然後插在冰上冰三分钟
5. 将cuvette中的菌液转至15mL乾净试管中
6. 将试管拿去30℃培养箱以250rpm培养2小时
7. 自培养2小时的试管取50uL及200uL菌液，涂盘於YPDS/Zeocin的固态培养基，以30度
培养3至10天
*问题就出在这里了,不知道是质体量不够,还是酵母菌出问题,还是哪个步骤有细节没注意
酵母菌不长就是不长,所以想请问各位版友指正,小弟感激您
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如来 那这么远的路，你们是怎么娱乐的？
★唐僧师徒 打怪升级
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◆ From: 114.35.131.185
1F：推 molkna:可以提高PLASMID的浓度到30~50ug不等，另外涂盘时zeocin 03/22 13:35
2F：→ molkna:的浓度是多少?可以先用zeocin100试试，有长再换到高浓度的 03/22 13:36
3F：→ molkna:步骤六我的方法是静置培养箱中，每15分钟震荡一次 03/22 13:37
4F：→ molkna:还有电完後我是加1ml 的1M sorbitol，你可以参考看看 03/22 13:38
5F：→ hellheavn:zeocin 100ug/mL 03/22 20:20