作者MrCAKE (Keep Working)
看板Biotech
標題Re: [求救] Purification fungi genomic DNA
時間Sun Mar 21 02:17:41 2010
我以前常抽絲狀真菌的DNA和RNA
你說的牛樟芝我也有抽過
我覺得你應該先告訴大家你如何得知DNA量太少
以及老闆如何判斷片段太小
DNA的用途為何?(如果只是要PCR 事實上隨便抽抽就可以了)
如果不提供這些資訊的話 真的很難幫上你的忙
※ 引述《ko363630 (打雜路人甲)》之銘言：
: 老闆最近要我抽牛樟芝的gDNA
: 我從自家的分生聖經以及學姐之前的做法下去做
: 雖然有很成功的抽出來
: 但是濃度卻是相當低，老闆說，可能是抽的時候DNA被切碎太多
: 但是我自己覺得不太可能，可能是牛樟芝用的量太少(取1g抽)
: 這是我們的實驗步驟
: 1.濾紙抽氣過濾(無菌水清洗)
: 2.液態氮研磨
: 3.每克菌絲加入4ml extration buffer
: 4.add 4ml phenol/chloroform
: 5.centrifuge(4oC、10000rpm、10min)
: 6.add 1/10 3M Sodium acetate(pH5.2) and 100%EtoH to supernatant at -20oC for
: 2hr
: 7.centrifuge(10000rpm、10min) desupernatants in RT
: 8.add 20mM Tris-HCL(pH:8.0)
: 9.add 1ug RNase in 37oC 30min 150rpm
: 10.add protease K (final concentration 150mg/ml) at 37oC for 60min
: 11.add phenol volume mix, centrifuge(4oC 12000rpm 10min)
: 12.add 1/10 3M Sodium acetate 3x voulme 100% EtoH (Final concentration 70%)
: at -20oC 30min
: 13.centrifuge(4oC 14000rpm 25min)
: 14.add 10mM Tris-HCL(pH:8.0)
: 這是我的實驗流程(第一次嘗試英文請不要care>"< 我才大二，英文還不好)
: 老闆說，這次抽出來的片段碎掉很多。之前曾想過改用lysis buffer 來破菌。
: 自己上網找qaigen、promega 的protocol但是找到大部分都是關於blood、trusses、
: plant、yeast(同樣都是fungi，但是不知道能不能用)
: 想請各位板上的大大不知道能不能提供一些經驗
: (要買kit的先不要好了= = 老闆聽到要花錢不知道會不會殺了我>"<)
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◆ From: 124.8.67.177
1F：→ ko363630:老闆打算用來建立 library 或者後續的clone 03/21 08:42
2F：→ ko363630:我自己定完量後 發現才23ng 量會少的原因 可能是他原本就 03/21 08:44
3F：→ ko363630:很少 不知道需不需要濃縮 03/21 08:44
4F：→ ko363630:老闆不是純生科系.所以有時候我也很懷疑老闆碩物理博生科 03/21 08:50
對於建library來說 這量的確太少
1g的牛樟芝是指菌絲還是子實體?
乾重還是濕重?(這是要釐清樣品是不是原本就太少)
還有DNA不只要看濃度 還要看純度
(對做library來說純度是非常重要的)
※ 編輯: MrCAKE 來自: 124.8.68.84 (03/21 10:22)
5F：→ wt1seven:做clone用要抽mRNA吧 再轉成cDNA 含intro 實驗目的為何? 03/21 14:52
原po好像沒有說他要做的是cDNA clone吧?
6F：→ wt1seven:有機會可增加 多找幾篇碩博士論文參考 別人是怎麼抽的 03/21 14:55
7F：→ ko363630:恩恩 好 謝謝前輩的指導 03/21 21:33
※ 編輯: MrCAKE 來自: 124.8.68.84 (03/21 23:07)