作者MrCAKE (Keep Working)
看板Biotech
标题Re: [求救] Purification fungi genomic DNA
时间Sun Mar 21 02:17:41 2010
我以前常抽丝状真菌的DNA和RNA
你说的牛樟芝我也有抽过
我觉得你应该先告诉大家你如何得知DNA量太少
以及老板如何判断片段太小
DNA的用途为何?(如果只是要PCR 事实上随便抽抽就可以了)
如果不提供这些资讯的话 真的很难帮上你的忙
※ 引述《ko363630 (打杂路人甲)》之铭言：
: 老板最近要我抽牛樟芝的gDNA
: 我从自家的分生圣经以及学姐之前的做法下去做
: 虽然有很成功的抽出来
: 但是浓度却是相当低，老板说，可能是抽的时候DNA被切碎太多
: 但是我自己觉得不太可能，可能是牛樟芝用的量太少(取1g抽)
: 这是我们的实验步骤
: 1.滤纸抽气过滤(无菌水清洗)
: 2.液态氮研磨
: 3.每克菌丝加入4ml extration buffer
: 4.add 4ml phenol/chloroform
: 5.centrifuge(4oC、10000rpm、10min)
: 6.add 1/10 3M Sodium acetate(pH5.2) and 100%EtoH to supernatant at -20oC for
: 2hr
: 7.centrifuge(10000rpm、10min) desupernatants in RT
: 8.add 20mM Tris-HCL(pH:8.0)
: 9.add 1ug RNase in 37oC 30min 150rpm
: 10.add protease K (final concentration 150mg/ml) at 37oC for 60min
: 11.add phenol volume mix, centrifuge(4oC 12000rpm 10min)
: 12.add 1/10 3M Sodium acetate 3x voulme 100% EtoH (Final concentration 70%)
: at -20oC 30min
: 13.centrifuge(4oC 14000rpm 25min)
: 14.add 10mM Tris-HCL(pH:8.0)
: 这是我的实验流程(第一次尝试英文请不要care>"< 我才大二，英文还不好)
: 老板说，这次抽出来的片段碎掉很多。之前曾想过改用lysis buffer 来破菌。
: 自己上网找qaigen、promega 的protocol但是找到大部分都是关於blood、trusses、
: plant、yeast(同样都是fungi，但是不知道能不能用)
: 想请各位板上的大大不知道能不能提供一些经验
: (要买kit的先不要好了= = 老板听到要花钱不知道会不会杀了我>"<)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 124.8.67.177
1F：→ ko363630:老板打算用来建立 library 或者後续的clone 03/21 08:42
2F：→ ko363630:我自己定完量後 发现才23ng 量会少的原因 可能是他原本就 03/21 08:44
3F：→ ko363630:很少 不知道需不需要浓缩 03/21 08:44
4F：→ ko363630:老板不是纯生科系.所以有时候我也很怀疑老板硕物理博生科 03/21 08:50
对於建library来说 这量的确太少
1g的牛樟芝是指菌丝还是子实体?
乾重还是湿重?(这是要厘清样品是不是原本就太少)
还有DNA不只要看浓度 还要看纯度
(对做library来说纯度是非常重要的)
※ 编辑: MrCAKE 来自: 124.8.68.84 (03/21 10:22)
5F：→ wt1seven:做clone用要抽mRNA吧 再转成cDNA 含intro 实验目的为何? 03/21 14:52
原po好像没有说他要做的是cDNA clone吧?
6F：→ wt1seven:有机会可增加 多找几篇硕博士论文参考 别人是怎麽抽的 03/21 14:55
7F：→ ko363630:恩恩 好 谢谢前辈的指导 03/21 21:33
※ 编辑: MrCAKE 来自: 124.8.68.84 (03/21 23:07)