作者icome (木村阿宅)
看板Biotech
標題[求救] 請問有人用過中研院lentivirus expression系統嗎?
時間Sat Mar 20 19:08:08 2010
我目前用中研院給的pLKO AS2.neo做virus
外源基因有成功接入
用LNCaP當作被感染的細胞
經感染後用G418處理約三天 沒有看到細胞有死亡的現象
且細胞型態有所改變 和使用shRNA病毒感染的狀況一樣
(變得較細長 因為對照組也有同樣狀態故應是一般狀況)
但是跑Western卻看不到所要表現的蛋白!!
一開始認為是cloning出問題 可能是frame shift
但是四組實驗組(獨立的construct)都同樣狀況 我當初用Pfu 效果應該不會這麼糟!
總之我會拿去定序 如果真的是四組都frame shift那也真是太賽了.. = =
我想請問的是 如果不是construct出錯 可能是哪裡有問題呢?
目前是猜測titer太低...但如果是MOI太低 在G418 selection時應該很多細胞死掉才對?
怎麼樣都想不透啊.......有人用這套系統成功表現過嗎? 感謝回答!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.62.135.23
※ 編輯: icome 來自: 61.62.135.23 (03/20 19:10)
1F：推 ranilla:我覺得G418來篩的時候，細胞死很慢可能是原因之一 03/20 19:37
2F：→ ranilla:RNAi core的，我是用puromycin的vector，兩天該死的就死了 03/20 19:38
3F：→ ranilla:其他非用RNAi core的vectore，但用G418來挑stable clone 03/20 19:39
4F：→ ranilla:如HEK，CHO cell，我是把serum減為5%，這樣死比較快 03/20 19:41
5F：推 liuse:G418 放一個星期 就會死了 別緊張 03/20 20:24
6F：→ icome:八天後細胞開始死了...看來的確是titer問題! THX 03/25 12:35