作者ko363630 (打雜路人甲)
看板Biotech
標題[求救] Purification fungi genomic DNA
時間Sat Mar 20 12:17:10 2010
老闆最近要我抽牛樟芝的gDNA
我從自家的分生聖經以及學姐之前的做法下去做
雖然有很成功的抽出來
但是濃度卻是相當低，老闆說，可能是抽的時候DNA被切碎太多
但是我自己覺得不太可能，可能是牛樟芝用的量太少(取1g抽)
這是我們的實驗步驟
1.濾紙抽氣過濾(無菌水清洗)
2.液態氮研磨
3.每克菌絲加入4ml extration buffer
4.add 4ml phenol/chloroform
5.centrifuge(4oC、10000rpm、10min)
6.add 1/10 3M Sodium acetate(pH5.2) and 100%EtoH to supernatant at -20oC for
2hr
7.centrifuge(10000rpm、10min) desupernatants in RT
8.add 20mM Tris-HCL(pH:8.0)
9.add 1ug RNase in 37oC 30min 150rpm
10.add protease K (final concentration 150mg/ml) at 37oC for 60min
11.add phenol volume mix, centrifuge(4oC 12000rpm 10min)
12.add 1/10 3M Sodium acetate 3x voulme 100% EtoH (Final concentration 70%)
at -20oC 30min
13.centrifuge(4oC 14000rpm 25min)
14.add 10mM Tris-HCL(pH:8.0)
這是我的實驗流程(第一次嘗試英文請不要care>"< 我才大二，英文還不好)
老闆說，這次抽出來的片段碎掉很多。之前曾想過改用lysis buffer 來破菌。
自己上網找qaigen、promega 的protocol但是找到大部分都是關於blood、trusses、
plant、yeast(同樣都是fungi，但是不知道能不能用)
想請各位板上的大大不知道能不能提供一些經驗
(要買kit的先不要好了= = 老闆聽到要花錢不知道會不會殺了我>"<)
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1F：推 ranilla:你該反問老闆切碎的DNA就不吸光了嗎？ 03/21 00:16
2F：→ ko363630:沒說我都沒想到 但是老闆的背景也不是純生科.... 03/21 08:49
3F：推 jennychine:破細胞的時候久一點吧. 03/23 14:34