作者ko363630 (打杂路人甲)
看板Biotech
标题[求救] Purification fungi genomic DNA
时间Sat Mar 20 12:17:10 2010
老板最近要我抽牛樟芝的gDNA
我从自家的分生圣经以及学姐之前的做法下去做
虽然有很成功的抽出来
但是浓度却是相当低，老板说，可能是抽的时候DNA被切碎太多
但是我自己觉得不太可能，可能是牛樟芝用的量太少(取1g抽)
这是我们的实验步骤
1.滤纸抽气过滤(无菌水清洗)
2.液态氮研磨
3.每克菌丝加入4ml extration buffer
4.add 4ml phenol/chloroform
5.centrifuge(4oC、10000rpm、10min)
6.add 1/10 3M Sodium acetate(pH5.2) and 100%EtoH to supernatant at -20oC for
2hr
7.centrifuge(10000rpm、10min) desupernatants in RT
8.add 20mM Tris-HCL(pH:8.0)
9.add 1ug RNase in 37oC 30min 150rpm
10.add protease K (final concentration 150mg/ml) at 37oC for 60min
11.add phenol volume mix, centrifuge(4oC 12000rpm 10min)
12.add 1/10 3M Sodium acetate 3x voulme 100% EtoH (Final concentration 70%)
at -20oC 30min
13.centrifuge(4oC 14000rpm 25min)
14.add 10mM Tris-HCL(pH:8.0)
这是我的实验流程(第一次尝试英文请不要care>"< 我才大二，英文还不好)
老板说，这次抽出来的片段碎掉很多。之前曾想过改用lysis buffer 来破菌。
自己上网找qaigen、promega 的protocol但是找到大部分都是关於blood、trusses、
plant、yeast(同样都是fungi，但是不知道能不能用)
想请各位板上的大大不知道能不能提供一些经验
(要买kit的先不要好了= = 老板听到要花钱不知道会不会杀了我>"<)
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◆ From: 123.195.250.187
1F：推 ranilla:你该反问老板切碎的DNA就不吸光了吗？ 03/21 00:16
2F：→ ko363630:没说我都没想到 但是老板的背景也不是纯生科.... 03/21 08:49
3F：推 jennychine:破细胞的时候久一点吧. 03/23 14:34