: ※ 引述《relaxsleep (火球連發~)》之銘言： : 請問各位 : 我目前在做pPICZaC分別插入三段片段 轉殖到P. pastoris X-33 : 先使用PmeI去切線性質體(需要clean up嗎?) 我是用pPICZaA 宿主用 Pichia pastoris KM71H 用Sac I 去切 (如果用Bgl II轉型率會低很多) 大概就是切在 AOX promoter 本身上游的部分會比較好 : : 升任細胞製作是培養3ml YPD overnight 30度 250rpm 24 h之後 OD600 = 12~13 : 在隔天取100ul接種到100ml YPD約八小時長到OD600 1.3~1.5 (時間會不會太短?) 接完之後OD600 = 0.15 比較好 大約6 h OD600 = 1~2 (5*10^7 cells/mL) 不過我沒養過X-33可能時間有差 第一次做的話可以多取幾個時間點測OD : 6000rpm離心去培養基 : 冰無菌水100ml重新懸浮5000 rpm離心 : 在使用50ml無菌水+4ml 1M sorbitol懸浮 5000rpm離心 : 在使用20ml 1M sorbitol懸浮 5000rpm離心 : 最後用200ul 1M sorbitol回溶得到勝任細胞 我用 3000 g 5 min 倒掉上清液 50 mL pre-treated buffer (10 mM Tris-HCl pH7.5, 10 mM DTT, 100 mM LiAc, 0.6 M sorbitol) 30度C 靜置 30 min (這個每次做現配, DTT使用前再加) 1500 g 10 min 2mL sorbitol wash 共 3 次 (可以吸到 2 mL eppendorf比較好操作, 各 1 mL) 最後 500 uL 回溶 80 uL 一管 大概會有 10^10 cells/mL : : 再把切好的質體10ul+80ul勝任細胞混勻 冰上5分鐘 : 1500V 15uF 335電阻 電擊 1500 V 25 uF 200 omega : 加入1ml 1M sorbitol放30度1.5小時 我靜置 1h : 塗YPDS plate 100ug/ml Zeocin 250 uL 塗一片 可以先滅好一堆L型波棒 先吹乾 plate 會塗比較快 : 養兩天挑菌 : 抽genomic DNA : 用5'AOX1 3'AOX1 primer PCR : 95度4 min 1cycle; 94 60sec, 55 60sec, 72 150sec 34cycle; 72 10min 1 cycle : 結果都只有P到菌體本身的AOX1 gene沒有轉入的基因 : 請問哪裡有問題 : 有研究的大大 幫忙指證一下 謝謝! --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.35.106 ※ 編輯: relaxsleep 來自: 140.129.35.106 (03/03 13:01) 我們家從轉形的plate挑300隻起來 一盤100隻 你可以自己先用 plate 畫圓形在紙上 然後畫格子 標好1~100 影印至少兩張 護貝 加上很小塊的泡棉在四個角落 就可以貼在 plate上 挑得很整齊 當然你想多挑或少挑也可以 Invitrogen 的書上是有 50個一盤的圖片你可以直接印來護貝 我會先挑到1X抗性的 也就是 100ug/mL 養兩三天之後 再全部挑到5X抗性的篩一次 因為雖然抗性好不見得表現量就好 可是表現量好的抗性一定好 然後你要注意挑的時候大家挑過去的菌要一樣多 5X 長完之後 就有兩種方法可以篩 一個是我比較愛用的 用試管小量培養 我會從3片各挑 9 9 10 共28隻 因為BioRad 系統小 well 的扣掉 Mr 可以有 14個well 一次可以跑兩片SDS-PAGE 另一種就是 你拿可以滅的96孔盤 不是ELISA用也不是一般定量protein用的 他是有蓋子的 哪家有賣我忘了 你可以打聽一下 然後自己用鋁箔紙做蓋子包住96孔盤 我會做兩層 然後上面用有色膠帶黏住兩邊讓他可以像開 tip 盒那樣打開 內層的鋁箔你可以每次做新的 就的就拿去外層用 兩層都蓋好之後 疊一疊用可以滅的塑膠袋包起來摺好拿去滅 烘乾之後再用 然後就是把菌用牙籤點進去 當然你要有可以滅的馬槽讓你用八爪加medium不然你會累死 我記得我們馬槽是訂做的 好像是手拉坯吧 = = 滅的時候就用市面上鮮奶加玉米脆片的那種組合包 他的瓶身跟蓋子是可以滅菌的 因為商品本身就是高溫高壓滅菌 那個盒子很好用 放馬槽剛好 點菌記得也要放 wild type 或者 negative control (轉空的 vector) 然後都弄好之後 他原本的上蓋(應該是壓克力做的吧 透明的)蓋在鋁箔蓋上面 壓克力的上蓋你可以酒精擦一擦之後先拿去照UV再用 把你的plate疊一疊 放在shaker上搖 就把類似試管架的那種鐵架 比較小比較扁的那種 倒過來放 然後用固定 incubator 放 shaker 四爪的那個圓盤去固定鐵架 再把疊好的plate綁在架子上 大概最多五片一疊 記得一定要綁好 然後就是每天誘導了 誘導完之後 就離心 有一種懸臂是可以放 96孔盤的 離完之後一樣吸上清液 直接加在 ELISA plate 上 當然你要先 coating 好你的抗體 然後就可以做 ELISA 了 有的人是酵素 所以就測活性 那不能測活性的蛋白就只能做ELISA 找相對量比較高的 喔對~250 rpm就好 300的話會把菌搖出來 最後 你可能會想說 96孔盤可以全都篩到可是好麻煩 說不定你們家沒有那種盤子 沒有定做的馬槽 沒有可以離96孔盤的懸臂 我自己是覺得真的很麻煩 而且如果是這樣子 他其實越靠中間的well越不容易搖起來 菌都會沉在下面 長不好表現量就不好了 也算是缺點 不過如果你家的 incubator 是可以讓轉盤傾斜大概20度吧那就不會搖不起來 所以我才會喜歡用試管篩 雖然量不多 可是我都是挑抗性最好的 試管表現完之後 我會從SDS-PAGE去判斷誰表現量高 再挑前五名用搖瓶再篩一次 因為搖瓶跟試管有差 試管表現量會比較好 而且看不太出來 protease 降解的情形 最後搖瓶篩完就只留兩隻 但只會用一隻啦 兩隻是保險 就做凍菌 凍菌最好一次做個很多 每次就拿一管來用 讓你每一批菌都一樣 我自己是覺得 雖然從300跳到28隻有點少 也有可能肉眼誤判 但是selection 就是這樣 挑到你要的就好了 如果他已經很不錯 就算有比他更好的幾隻被你遺漏但是也不重要了 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.74.19 ※ 編輯: littlelizard 來自: 140.112.74.19 (03/10 21:10)