: ※ 引述《relaxsleep (火球连发~)》之铭言： : 请问各位 : 我目前在做pPICZaC分别插入三段片段 转殖到P. pastoris X-33 : 先使用PmeI去切线性质体(需要clean up吗?) 我是用pPICZaA 宿主用 Pichia pastoris KM71H 用Sac I 去切 (如果用Bgl II转型率会低很多) 大概就是切在 AOX promoter 本身上游的部分会比较好 : : 升任细胞制作是培养3ml YPD overnight 30度 250rpm 24 h之後 OD600 = 12~13 : 在隔天取100ul接种到100ml YPD约八小时长到OD600 1.3~1.5 (时间会不会太短?) 接完之後OD600 = 0.15 比较好 大约6 h OD600 = 1~2 (5*10^7 cells/mL) 不过我没养过X-33可能时间有差 第一次做的话可以多取几个时间点测OD : 6000rpm离心去培养基 : 冰无菌水100ml重新悬浮5000 rpm离心 : 在使用50ml无菌水+4ml 1M sorbitol悬浮 5000rpm离心 : 在使用20ml 1M sorbitol悬浮 5000rpm离心 : 最後用200ul 1M sorbitol回溶得到胜任细胞 我用 3000 g 5 min 倒掉上清液 50 mL pre-treated buffer (10 mM Tris-HCl pH7.5, 10 mM DTT, 100 mM LiAc, 0.6 M sorbitol) 30度C 静置 30 min (这个每次做现配, DTT使用前再加) 1500 g 10 min 2mL sorbitol wash 共 3 次 (可以吸到 2 mL eppendorf比较好操作, 各 1 mL) 最後 500 uL 回溶 80 uL 一管 大概会有 10^10 cells/mL : : 再把切好的质体10ul+80ul胜任细胞混匀 冰上5分钟 : 1500V 15uF 335电阻 电击 1500 V 25 uF 200 omega : 加入1ml 1M sorbitol放30度1.5小时 我静置 1h : 涂YPDS plate 100ug/ml Zeocin 250 uL 涂一片 可以先灭好一堆L型波棒 先吹乾 plate 会涂比较快 : 养两天挑菌 : 抽genomic DNA : 用5'AOX1 3'AOX1 primer PCR : 95度4 min 1cycle; 94 60sec, 55 60sec, 72 150sec 34cycle; 72 10min 1 cycle : 结果都只有P到菌体本身的AOX1 gene没有转入的基因 : 请问哪里有问题 : 有研究的大大 帮忙指证一下 谢谢! --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.35.106 ※ 编辑: relaxsleep 来自: 140.129.35.106 (03/03 13:01) 我们家从转形的plate挑300只起来 一盘100只 你可以自己先用 plate 画圆形在纸上 然後画格子 标好1~100 影印至少两张 护贝 加上很小块的泡棉在四个角落 就可以贴在 plate上 挑得很整齐 当然你想多挑或少挑也可以 Invitrogen 的书上是有 50个一盘的图片你可以直接印来护贝 我会先挑到1X抗性的 也就是 100ug/mL 养两三天之後 再全部挑到5X抗性的筛一次 因为虽然抗性好不见得表现量就好 可是表现量好的抗性一定好 然後你要注意挑的时候大家挑过去的菌要一样多 5X 长完之後 就有两种方法可以筛 一个是我比较爱用的 用试管小量培养 我会从3片各挑 9 9 10 共28只 因为BioRad 系统小 well 的扣掉 Mr 可以有 14个well 一次可以跑两片SDS-PAGE 另一种就是 你拿可以灭的96孔盘 不是ELISA用也不是一般定量protein用的 他是有盖子的 哪家有卖我忘了 你可以打听一下 然後自己用铝箔纸做盖子包住96孔盘 我会做两层 然後上面用有色胶带黏住两边让他可以像开 tip 盒那样打开 内层的铝箔你可以每次做新的 就的就拿去外层用 两层都盖好之後 叠一叠用可以灭的塑胶袋包起来摺好拿去灭 烘乾之後再用 然後就是把菌用牙签点进去 当然你要有可以灭的马槽让你用八爪加medium不然你会累死 我记得我们马槽是订做的 好像是手拉坯吧 = = 灭的时候就用市面上鲜奶加玉米脆片的那种组合包 他的瓶身跟盖子是可以灭菌的 因为商品本身就是高温高压灭菌 那个盒子很好用 放马槽刚好 点菌记得也要放 wild type 或者 negative control (转空的 vector) 然後都弄好之後 他原本的上盖(应该是压克力做的吧 透明的)盖在铝箔盖上面 压克力的上盖你可以酒精擦一擦之後先拿去照UV再用 把你的plate叠一叠 放在shaker上摇 就把类似试管架的那种铁架 比较小比较扁的那种 倒过来放 然後用固定 incubator 放 shaker 四爪的那个圆盘去固定铁架 再把叠好的plate绑在架子上 大概最多五片一叠 记得一定要绑好 然後就是每天诱导了 诱导完之後 就离心 有一种悬臂是可以放 96孔盘的 离完之後一样吸上清液 直接加在 ELISA plate 上 当然你要先 coating 好你的抗体 然後就可以做 ELISA 了 有的人是酵素 所以就测活性 那不能测活性的蛋白就只能做ELISA 找相对量比较高的 喔对~250 rpm就好 300的话会把菌摇出来 最後 你可能会想说 96孔盘可以全都筛到可是好麻烦 说不定你们家没有那种盘子 没有定做的马槽 没有可以离96孔盘的悬臂 我自己是觉得真的很麻烦 而且如果是这样子 他其实越靠中间的well越不容易摇起来 菌都会沉在下面 长不好表现量就不好了 也算是缺点 不过如果你家的 incubator 是可以让转盘倾斜大概20度吧那就不会摇不起来 所以我才会喜欢用试管筛 虽然量不多 可是我都是挑抗性最好的 试管表现完之後 我会从SDS-PAGE去判断谁表现量高 再挑前五名用摇瓶再筛一次 因为摇瓶跟试管有差 试管表现量会比较好 而且看不太出来 protease 降解的情形 最後摇瓶筛完就只留两只 但只会用一只啦 两只是保险 就做冻菌 冻菌最好一次做个很多 每次就拿一管来用 让你每一批菌都一样 我自己是觉得 虽然从300跳到28只有点少 也有可能肉眼误判 但是selection 就是这样 挑到你要的就好了 如果他已经很不错 就算有比他更好的几只被你遗漏但是也不重要了 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.74.19 ※ 编辑: littlelizard 来自: 140.112.74.19 (03/10 21:10)