作者Wacha (Wacha)
看板Biotech
標題[求救] Western blot靠近兩邊的lane訊號較弱
時間Wed Mar 10 07:19:26 2010
我做 Western blot時不論什麼sample都經常發生靠近兩
旁的band訊號較弱，中間的band訊號較強，請問有先進能
指點我如何改進嗎？謝謝！
1st antibody 1:1000配成 1ml，用封口機封好塑膠袋後
4C放overnight (最近開始塑膠袋上下有用tip盒夾住，
再加一點重量壓平)
2nd antibody 1:10000 配成 10ml, shaker搖1hr
ECL做 1 min,有用1000ul的tip"桿"membrane,使ECL均
勻分散，不致於集中在一沱。
milk濃度 5%
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 128.32.214.112
1F：推 boblu:直覺跟 transfer 有關。有染過 coomassie blue 看看嗎? 03/10 08:07
謝謝您的回答。
我本來用semi-dry transfer，後來改用wet transfer
transfer完有用 Ponceau S染過,通常各個lane不會差很多
我放完2nd antibody用shaker搖時，牛奶流動的方向和lane平行，
不知道是不是因此造成不均勻，因為有時後mambrane會有些微彎曲，
靠近兩邊的lane浸入牛奶的深度可能較淺。
當然不能排除一開始protein的濃度就沒測準，不過每次都是中間
的band比較黑實在很困擾。
※ 編輯: Wacha 來自: 128.32.214.112 (03/10 09:31)
2F：→ sjacky:我是覺得一抗的體積太少，只有1ml，10個lane我最少3ml -,- 03/10 22:54
3F：→ sjacky:另外你的mambrane有裁切的剛剛好嗎？如果可以的話，左右兩 03/10 22:54
4F：→ sjacky:邊各多留一點寬度，或是包的時候左右兩邊不要剛剛好,長一點 03/10 22:55
5F：→ Wacha:Thanks! I'll try. 03/11 01:08
6F：→ kcc0606:ECL是否均勻 是在加下去的那一瞬間 用桿的已太晚 05/07 22:27
7F：→ kcc0606:你的問題可能是ECL加的不夠均勻. 05/07 22:29