作者Wacha (Wacha)
看板Biotech
标题[求救] Western blot靠近两边的lane讯号较弱
时间Wed Mar 10 07:19:26 2010
我做 Western blot时不论什麽sample都经常发生靠近两
旁的band讯号较弱，中间的band讯号较强，请问有先进能
指点我如何改进吗？谢谢！
1st antibody 1:1000配成 1ml，用封口机封好塑胶袋後
4C放overnight (最近开始塑胶袋上下有用tip盒夹住，
再加一点重量压平)
2nd antibody 1:10000 配成 10ml, shaker摇1hr
ECL做 1 min,有用1000ul的tip"杆"membrane,使ECL均
匀分散，不致於集中在一沱。
milk浓度 5%
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 128.32.214.112
1F：推 boblu:直觉跟 transfer 有关。有染过 coomassie blue 看看吗? 03/10 08:07
谢谢您的回答。
我本来用semi-dry transfer，後来改用wet transfer
transfer完有用 Ponceau S染过,通常各个lane不会差很多
我放完2nd antibody用shaker摇时，牛奶流动的方向和lane平行，
不知道是不是因此造成不均匀，因为有时後mambrane会有些微弯曲，
靠近两边的lane浸入牛奶的深度可能较浅。
当然不能排除一开始protein的浓度就没测准，不过每次都是中间
的band比较黑实在很困扰。
※ 编辑: Wacha 来自: 128.32.214.112 (03/10 09:31)
2F：→ sjacky:我是觉得一抗的体积太少，只有1ml，10个lane我最少3ml -,- 03/10 22:54
3F：→ sjacky:另外你的mambrane有裁切的刚刚好吗？如果可以的话，左右两 03/10 22:54
4F：→ sjacky:边各多留一点宽度，或是包的时候左右两边不要刚刚好,长一点 03/10 22:55
5F：→ Wacha:Thanks! I'll try. 03/11 01:08
6F：→ kcc0606:ECL是否均匀 是在加下去的那一瞬间 用杆的已太晚 05/07 22:27
7F：→ kcc0606:你的问题可能是ECL加的不够均匀. 05/07 22:29