作者wansue (永遠的彼得潘)
看板Biotech
標題Re: [求救] 酵母菌 transformation
時間Tue Mar 9 17:38:24 2010
※ 引述《wansue (永遠的彼得潘)》之銘言：
※ 引述《wansue (永遠的彼得潘)》之銘言：
: 最近在做酵母菌的轉型，所使用的buffer等材料都有滅過菌，
: 可是負對照一直有長菌(做了n次都是一樣的結果)，請問會是哪裡出了問題??
(長的是酵母菌)
: p.s使用invitrogen kit所示的方法步驟(lithum acetate)
1. 10ml YPD養 YEAST， 30度C 培養overnight
2. transfer to 50ml fresh YPD，30度C 培養4小時
3. 1500 rpm 離心5分鐘，再以40ml的1xTE 懸浮
4. 1500 rpm 離心5分鐘 ，以2ml 1xLiAc/0.5xTE 懸浮 置室溫10分鐘
5. 1ug plasmid DNA + 100ug denatured salmon sperm DNA + 100ul 步驟4的菌液
+ 700ul 的 1xLiAc/40%PEG-3350/1xTE 混合均勻後30度C培養30分鐘
6. 加88ul DMSO混勻 42度C 7分鐘
7. 離心10秒 移除上清液，以1ml 1xTE懸浮
8. 離心10秒 移除上清液，以100ul 1xTE懸浮後塗盤(YPD plate + 25ug Blasticidin)
9. 30度C培養兩天
p.s 質體為pYC6 菌種為INVSc1
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◆ From: 140.112.154.104
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1F：推 bluecsky:Blasticidin歐..你們配plate的時候有沒有降溫後才加? 03/09 19:19
2F：→ bluecsky:這類抗生素滿怕熱跟光的 plate保存也要盡量在4度跟遮光 03/09 19:20
3F：→ bluecsky:還有不知道你們的Blasticidin是否夠量..我還要再查查看 03/09 19:20
4F：→ bluecsky:才能跟你說(人不在labXD) 03/09 19:21
5F：→ bluecsky:還有Blasticidin是否還在保存期限內 超過的話其實還可以 03/09 19:21
6F：→ bluecsky:不過要補更多量就是了 03/09 19:21
7F：→ puec2:如果長得是yeast的話有可能Blasticidin壞掉。 03/09 20:19
8F：→ puec2:或者你手上的yeast裡面根本就已經有plasmid在裡面了... 03/09 20:19
9F：→ puec2:我覺得後者比較有可能..人心哪.... 03/09 20:20
10F：→ wansue:抗生素還在保存期限內，加的時候大概是55度C左右 03/10 11:22
11F：推 relaxsleep:我想請問一下 1500rpm能夠完全離心下來嗎? 03/10 12:48
12F：推 owl628:我也覺得1500rmp太慢,我們都用到3000rpm或更高一點 03/10 15:07