作者wansue (永远的彼得潘)
看板Biotech
标题Re: [求救] 酵母菌 transformation
时间Tue Mar 9 17:38:24 2010
※ 引述《wansue (永远的彼得潘)》之铭言：
※ 引述《wansue (永远的彼得潘)》之铭言：
: 最近在做酵母菌的转型，所使用的buffer等材料都有灭过菌，
: 可是负对照一直有长菌(做了n次都是一样的结果)，请问会是哪里出了问题??
(长的是酵母菌)
: p.s使用invitrogen kit所示的方法步骤(lithum acetate)
1. 10ml YPD养 YEAST， 30度C 培养overnight
2. transfer to 50ml fresh YPD，30度C 培养4小时
3. 1500 rpm 离心5分钟，再以40ml的1xTE 悬浮
4. 1500 rpm 离心5分钟 ，以2ml 1xLiAc/0.5xTE 悬浮 置室温10分钟
5. 1ug plasmid DNA + 100ug denatured salmon sperm DNA + 100ul 步骤4的菌液
+ 700ul 的 1xLiAc/40%PEG-3350/1xTE 混合均匀後30度C培养30分钟
6. 加88ul DMSO混匀 42度C 7分钟
7. 离心10秒 移除上清液，以1ml 1xTE悬浮
8. 离心10秒 移除上清液，以100ul 1xTE悬浮後涂盘(YPD plate + 25ug Blasticidin)
9. 30度C培养两天
p.s 质体为pYC6 菌种为INVSc1
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◆ From: 140.112.154.104
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1F：推 bluecsky:Blasticidin欧..你们配plate的时候有没有降温後才加? 03/09 19:19
2F：→ bluecsky:这类抗生素满怕热跟光的 plate保存也要尽量在4度跟遮光 03/09 19:20
3F：→ bluecsky:还有不知道你们的Blasticidin是否够量..我还要再查查看 03/09 19:20
4F：→ bluecsky:才能跟你说(人不在labXD) 03/09 19:21
5F：→ bluecsky:还有Blasticidin是否还在保存期限内 超过的话其实还可以 03/09 19:21
6F：→ bluecsky:不过要补更多量就是了 03/09 19:21
7F：→ puec2:如果长得是yeast的话有可能Blasticidin坏掉。 03/09 20:19
8F：→ puec2:或者你手上的yeast里面根本就已经有plasmid在里面了... 03/09 20:19
9F：→ puec2:我觉得後者比较有可能..人心哪.... 03/09 20:20
10F：→ wansue:抗生素还在保存期限内，加的时候大概是55度C左右 03/10 11:22
11F：推 relaxsleep:我想请问一下 1500rpm能够完全离心下来吗? 03/10 12:48
12F：推 owl628:我也觉得1500rmp太慢,我们都用到3000rpm或更高一点 03/10 15:07