作者jokefunny (就可方泥)
看板Biotech
標題[方法] RT-PCRㄧ些事情請教
時間Mon Mar 8 00:02:04 2010
請問一下大家
因為我在做RT-PCR
最後要定量
想請問一下有做過的人一些意見
請問一下
在把RNA轉成cDNA時
大家都用多少 ng/ul的RNA去轉呢?
假如使用50 ng/ul濃度的RNA stock
接著用10ul(管內RNA數量500ng)去做RT
這樣做的出來嗎
因為平常用的RNA濃度很高
所以想要降低濃度做看看
先請問一下大家有無相關經驗可以指導一下
因為我在定internal control都不好定量
因此想問假如一開始轉RT這步驟 將濃度往下調
是不是會比較好定量
比較不容易因為人為因素使的每管濃不不一樣
因為我想說假使濃度低一點
手誤的機率也能往下修一下
請有經驗的可以分享點定量的經驗給小弟我ㄧ下
謝謝大家了 囧
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.227.185.125
1F：→ fc01:我沒有實作過,但是我聽special list上課的時候是講 03/08 00:57
2F：→ fc01:一開始要把sample稀釋去試吧,原液,10x,50x,100x這樣去試 03/08 00:58
嗯 關於稀釋
我也是這麼想
因為我的作法是RNA放乾後 直接加入20ul水稀釋
而我做RT時 直接先計算好
接下來每管抽1.X ul去反轉錄成cDNA
我在想 會不會是因為我濃度太高
造成根本就吸不準
就算我已經算好每管吸取多少
但是因為吸取的差距太小
例如6管的話
各加入1.01 1.15 1.5 1.93 1.02 1.2
導致一定會有失誤出現
所以才會有所疑惑
是不是要先稀釋到ㄧ定倍數
例如稀釋到50ng
然後每管取10ul (取10ul算是很大的量)
跟我每管取1.x ul比而言
會比較ㄧ致
所以希望有經驗的大大可以分享依下
※ 編輯: jokefunny 來自: 61.227.185.125 (03/08 02:04)
3F：推 icome:RNA抽好定量 每管反應的量根據廠商的protocol加 03/08 11:46
4F：→ icome:我們家用invitrogen 每管反應體積20ul RNA 5ug 03/08 11:48
5F：→ icome:RNA量要定準 太多太少都會影響RT效率 03/08 11:48