作者jokefunny (就可方泥)
看板Biotech
标题[方法] RT-PCRㄧ些事情请教
时间Mon Mar 8 00:02:04 2010
请问一下大家
因为我在做RT-PCR
最後要定量
想请问一下有做过的人一些意见
请问一下
在把RNA转成cDNA时
大家都用多少 ng/ul的RNA去转呢?
假如使用50 ng/ul浓度的RNA stock
接着用10ul(管内RNA数量500ng)去做RT
这样做的出来吗
因为平常用的RNA浓度很高
所以想要降低浓度做看看
先请问一下大家有无相关经验可以指导一下
因为我在定internal control都不好定量
因此想问假如一开始转RT这步骤 将浓度往下调
是不是会比较好定量
比较不容易因为人为因素使的每管浓不不一样
因为我想说假使浓度低一点
手误的机率也能往下修一下
请有经验的可以分享点定量的经验给小弟我ㄧ下
谢谢大家了 囧
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.227.185.125
1F：→ fc01:我没有实作过,但是我听special list上课的时候是讲 03/08 00:57
2F：→ fc01:一开始要把sample稀释去试吧,原液,10x,50x,100x这样去试 03/08 00:58
嗯 关於稀释
我也是这麽想
因为我的作法是RNA放乾後 直接加入20ul水稀释
而我做RT时 直接先计算好
接下来每管抽1.X ul去反转录成cDNA
我在想 会不会是因为我浓度太高
造成根本就吸不准
就算我已经算好每管吸取多少
但是因为吸取的差距太小
例如6管的话
各加入1.01 1.15 1.5 1.93 1.02 1.2
导致一定会有失误出现
所以才会有所疑惑
是不是要先稀释到ㄧ定倍数
例如稀释到50ng
然後每管取10ul (取10ul算是很大的量)
跟我每管取1.x ul比而言
会比较ㄧ致
所以希望有经验的大大可以分享依下
※ 编辑: jokefunny 来自: 61.227.185.125 (03/08 02:04)
3F：推 icome:RNA抽好定量 每管反应的量根据厂商的protocol加 03/08 11:46
4F：→ icome:我们家用invitrogen 每管反应体积20ul RNA 5ug 03/08 11:48
5F：→ icome:RNA量要定准 太多太少都会影响RT效率 03/08 11:48