作者Fourfish (～四條魚～)
看板Biotech
標題[討論] 有用KpnI/BglII很難ligation的八卦嘛..??
時間Sun Mar 7 02:05:53 2010
我這陣子在建立promoter assay要用的plasmid
Vector是pGL3-basic 要接進去的insert長度有800bp - 1.5kb
Vector跟insert我都用KpnI + BglII (NEB)做double digestion 3hr
用gel extraction純化後做ligation 4度C O/N
結果transformation都沒colony....= =a
比例我從5:1抓到2:1 (insert:vector) 沒用...
Vector用量從20ng做到100ng 也沒用....
所以我一直在懷疑是不是KpnI/BglII就是比較難ligation??
有沒有其他板友有這種經驗的？
(用pGL3有神祕技巧?? 或曾經也覺得某些RE做clone不太好做的...??)
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.64.93.103
1F：推 oplz:問八卦可以去八卦版啊.... 03/07 07:23
2F：推 liuse:16度O/N ?? ration用1:10 ?? 兩個我的建議 03/07 08:24
3F：→ liuse:final transform recover 用SOC 03/07 08:24
4F：推 tsubasawolfy:blunt end ligation用的comptent cell品質要好 03/07 08:27
5F：→ tsubasawolfy:阿 沒事把BglII看成另一個Orz 03/07 08:28
6F：→ Fourfish:16度O/N我是沒試過 不過我做其他vector4度O/N都還OK 所以 03/07 11:24
7F：→ Fourfish:這應該不是問題 請教用SOC recover的好處或幫助是..@@?? 03/07 11:25
8F：推 oplz:to express more antibiotic proteins in short time 03/07 13:46
9F：推 oplz:trouble shoot: digest kpnI or BglII individually, seeing 03/07 13:49
10F：→ oplz:if either of them is dead. 03/07 13:49
11F：→ oplz:recheck if you are using correct antibiotic for selection 03/07 13:50
12F：→ oplz:recheck if your insert DNA has both RE sites at ends. 03/07 13:51
13F：→ oplz:ask another labmate try it for you 03/07 13:52
14F：→ Fourfish:感謝上面各位 我曾想過是不是insert的promoter影響菌生長 03/07 16:53
15F：→ Fourfish:特別是antibiotic protein 所以我會試試用SOC作recover 03/07 16:53
16F：→ Fourfish:實驗結果是...換成SOC也是沒用 XD 03/10 12:04
17F：推 tsubasawolfy:你要先考慮的問題是RE到底有沒有切好 03/10 14:24
18F：推 firstfrost:pGL3-basic我也接到快爛掉= =已經接了40多個construct 03/24 03:04
19F：→ firstfrost:我是用1:6的molar ratio vector用50ng 03/24 03:05
20F：→ firstfrost:我是用NheI BglII的切點 03/24 03:06