作者Fourfish (～四条鱼～)
看板Biotech
标题[讨论] 有用KpnI/BglII很难ligation的八卦嘛..??
时间Sun Mar 7 02:05:53 2010
我这阵子在建立promoter assay要用的plasmid
Vector是pGL3-basic 要接进去的insert长度有800bp - 1.5kb
Vector跟insert我都用KpnI + BglII (NEB)做double digestion 3hr
用gel extraction纯化後做ligation 4度C O/N
结果transformation都没colony....= =a
比例我从5:1抓到2:1 (insert:vector) 没用...
Vector用量从20ng做到100ng 也没用....
所以我一直在怀疑是不是KpnI/BglII就是比较难ligation??
有没有其他板友有这种经验的？
(用pGL3有神秘技巧?? 或曾经也觉得某些RE做clone不太好做的...??)
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.64.93.103
1F：推 oplz:问八卦可以去八卦版啊.... 03/07 07:23
2F：推 liuse:16度O/N ?? ration用1:10 ?? 两个我的建议 03/07 08:24
3F：→ liuse:final transform recover 用SOC 03/07 08:24
4F：推 tsubasawolfy:blunt end ligation用的comptent cell品质要好 03/07 08:27
5F：→ tsubasawolfy:阿 没事把BglII看成另一个Orz 03/07 08:28
6F：→ Fourfish:16度O/N我是没试过 不过我做其他vector4度O/N都还OK 所以 03/07 11:24
7F：→ Fourfish:这应该不是问题 请教用SOC recover的好处或帮助是..@@?? 03/07 11:25
8F：推 oplz:to express more antibiotic proteins in short time 03/07 13:46
9F：推 oplz:trouble shoot: digest kpnI or BglII individually, seeing 03/07 13:49
10F：→ oplz:if either of them is dead. 03/07 13:49
11F：→ oplz:recheck if you are using correct antibiotic for selection 03/07 13:50
12F：→ oplz:recheck if your insert DNA has both RE sites at ends. 03/07 13:51
13F：→ oplz:ask another labmate try it for you 03/07 13:52
14F：→ Fourfish:感谢上面各位 我曾想过是不是insert的promoter影响菌生长 03/07 16:53
15F：→ Fourfish:特别是antibiotic protein 所以我会试试用SOC作recover 03/07 16:53
16F：→ Fourfish:实验结果是...换成SOC也是没用 XD 03/10 12:04
17F：推 tsubasawolfy:你要先考虑的问题是RE到底有没有切好 03/10 14:24
18F：推 firstfrost:pGL3-basic我也接到快烂掉= =已经接了40多个construct 03/24 03:04
19F：→ firstfrost:我是用1:6的molar ratio vector用50ng 03/24 03:05
20F：→ firstfrost:我是用NheI BglII的切点 03/24 03:06